Konstruerar en tvåskiktad Hydrogel till Control ASC differentiering
Summary
Detta protokoll är inriktad på användning av den inneboende förmågan hos stamceller att ta kö från den omgivande extracellulära matrisen och induceras till att differentiera till flera fenotyper. Detta sätt manuskript sträcker vår beskrivning och karakterisering av en modell som utnyttjar en tvåskiktad hydrogel, som består av PEG-fibrin och kollagen, för att samtidigt tillsammans differentiera adipos-härledda stamceller<sup> 1</sup>.
Abstract
Naturliga polymerer genom åren har fått större betydelse på grund av sin värd biokompatibilitet och förmåga att samverka med celler in vitro och in vivo. Ett forskningsområde som håller löftet i regenerativ medicin är kombinatoriska användning av nya biomaterial och stamceller. En grundläggande strategi inom tissue engineering är användningen av tredimensionella ställning (t.ex. decellulariseras extracellulär matris, hydrogeler, mikro / nano partiklar) för att styra cellernas funktion. Denna teknik har utvecklats från upptäckten att celler behöver ett substrat på vilket de kan ansluta sig, föröka, och uttrycka sin differentierade cellulära fenotyp och funktion 2-3. Mer nyligen har det också konstaterats att cellerna inte bara använda dessa substrat för vidhäftning, utan även interagera och ta signaler från matrisen substratet (t.ex. extracellulära matrisen, ECM) 4. Därför är de celler och ställningar har en ömsesidig anslutning somtjänar till att kontrollera vävnad utveckling, organisation och Ultimate funktion. Fett-härledda stamceller (DSKer) är mesenkymal, icke-hematopoetiska stamceller som finns i fettvävnad som kan uppvisa flera härstamning differentiering och fungera som en lättillgänglig källa av celler (dvs pre-vaskulära endotel och pericyter). Vår hypotes är att adipos-härledda stamceller kan riktas mot olika fenotyper samtidigt genom att helt enkelt sam-odling av dem i tvåskiktade matriser 1. Vårt laboratorium är inriktad på dermal sårläkning. För detta ändamål har vi skapat en enda sammansatt matris från de naturliga biomaterial, fibrin, kollagen och kitosan som kan efterlikna de egenskaper och funktioner hos en dermal-specifik sårläkning ECM miljö.
Protocol
Discussion
DSKer är väl kända för sin lätthet av isolering och förmåga att differentiera mot olika celltyper. Med de tekniker som beskrivs i detta manuskript kan vi att utnyttja plasticitet av ASC: er genom att exponera dessa celler till flera biomatrices samtidigt. Som celler migrera bort från sin CSM bas och ange sitt omgivande extracellulära miljön, cellerna tar kö från ställningen och kan antingen behålla "stemness" (kollagen) eller induceras att differentiera mot vaskulära-och vaskulär-stödjande cel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN fick stöd av postdoktorsstipendium Grant från Pittsburgh Tissue Engineering Initiative. Doz stöds av ett bidrag som beviljats från The Geneva Foundation.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C8106 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-Oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Fibrinogen | Sigma | F3879 | Consumable |
| Thrombin | Sigma | T6884 | Consumable |
| Benztriazole Derivative of Polyethylene | Sunbio | DE-034GS | Consumable |
| Tris Buffer Tablet (pH 7.6) | Sigma | T5030 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
- Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
- Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. , (2008).
- Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
- Bubnis, W. A., Ofner, M. C. The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
- Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
- Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
- Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
