Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche
Summary
Un metodo per la cultura un monostrato di cellule endoteliali durante l'intera superficie interna 3D di un dispositivo a microfluidi con microvascolare canali di dimensioni (<30 micron) è descritta. Questo<em> In vitro</em> Modello microvascolarizzazione consente lo studio di interazioni tra le cellule del sangue biofisiche, cellule endoteliali, e fattori solubili in malattie ematologiche.
Abstract
I progressi nelle tecniche di microfabbricazione hanno permesso la produzione di sistemi microfluidici economici e riproducibili per lo svolgimento di esperimenti biologici e biochimici alla micro-scala nanometrica e 1,2. Inoltre, microfluidica sono stati specificamente utilizzato per analizzare quantitativamente processi ematologiche e microvascolari, a causa della loro capacità di controllare facilmente il ambiente dinamico fluidico condizioni biologiche e 3-6. Come tale, i ricercatori hanno più recentemente usati sistemi microfluidici per studiare deformabilità delle cellule del sangue, cellule aggregazione e flusso sanguigno microvascolare, e globuli-endoteliali interazioni cellulari 6-13. Tuttavia, questi sistemi microfluidici o non includere una coltura di cellule endoteliali o erano più grandi più pertinenti sizescale microvascolari di processi patologici. Una piattaforma microfluidica con colture di cellule endoteliali che riassume con precisione il cellulare, fisico e hemodynambiente Amic della microcircolazione è necessaria per migliorare la nostra comprensione della fisiopatologia sottostante biofisico di malattie ematologiche che coinvolgono il microcircolo.
Qui riportiamo un metodo per creare un "endothelialized" modello in vitro del microcircolo, con un semplice, singolo processo di microfabbricazione maschera in combinazione con tecniche di celle standard endoteliali coltura, per studiare le interazioni patologiche microvascolari biofisiche che si verificano nella malattia ematologica. Questo "microcircolo-on-a-chip" fornisce il ricercatore con un saggio robusto che controlla strettamente biologica nonché delle condizioni biofisiche e viene gestito tramite una pompa standard siringa e brightfield / microscopia a fluorescenza. Parametri quali le condizioni emodinamiche microcircolazione, il tipo di cellule endoteliali, le cellule del sangue di tipo (s) e di concentrazione (s), la droga / concentrazione inibitoria, ecc, possono essere facilmente controllati. Come tale, il microsistema fornisceun metodo per indagare quantitativamente processi patologici in cui viene compromessa flusso microvascolare causa di alterazioni nella adesione cellulare, aggregazione, e deformabilità, una capacità disponibile con saggi esistenti.
Protocol
Discussion
Il nostro sistema Microdevice endothelialized è più adatto se usato in combinazione con gli esperimenti in vivo, e il suo approccio riduzionista può aiutare a chiarire i meccanismi dei processi biofisici ematologiche che si osservano negli esseri umani e modelli animali. Inoltre, il nostro sistema non è senza limiti. Per esempio, i nostri canali microfluidici sono quadrati in sezione trasversale. Anche se tecnicamente microcanali circolari possono essere fabbricate 10,11, abbiamo scelto di utiliz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo T. Hunt, M. Rosenbluth, e il Laboratorio Lam per i loro consigli e le discussioni utili. Noi riconosciamo il sostegno G. Spinner e l'Istituto di Elettronica e Nanotecnologia presso il Georgia Institute of Technology. Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito dal NIH una sovvenzione di K08-HL093360, UCSF premio REAC, uno nanomedicina NIH Award PN2EY018244 Development Center, e il finanziamento del Centro di Biologia delle cellule endoteliali Healthcare dei bambini di Atlanta.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2″, pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020″ ID x 0.060″ OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012″ ID x 0.030″ OD |
References
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. v. a. n. d. e. r., Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -. J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
