Выделение и культуры крысы эмбриональных нервных клеток: Быстрый протокол
Summary
Мы описываем методологию быстрой, чтобы изолировать и культуры гиппокампе и коре нейроны от грызунов эмбрионов. Этот протокол позволяет проводить эксперименты, в которых почти чистой культуры нейронов не требуется.
Abstract
Мы описываем быстрый способ отделить и культуры гиппокампа и коры нейроны от E15-17 крысиных эмбрионов. Эта процедура может быть успешно применен для выделения мышиных и человеческих первичных нейронов и нейронных предшественников. Диссоциированных нейронов поддерживается в бессывороточной среде до нескольких недель. Эти культуры могут быть использованы для nucleofection, иммуноцитохимия, нуклеиновых кислот подготовки, а также электрофизиологии. Пожилые нейронов культуры можно трансфекции с хорошей скоростью эффективность лентивирусов трансдукции и менее эффективно, с фосфатом кальция или на основе липидов такие методы, как липофектамина.
Protocol
Discussion
Метод вскрытия и культуры гиппокампа крыс и корковых нейронов описаны здесь позволяет проводить эксперименты с использованием почти чистый нейронных культур, выращенных в химически определенной среде (рис. 3). Хотя протоколы для культивирования почти чистый нейронов в сывор?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Jonna Ellis за помощь в редактировании. Проект описан была поддержана премии Количество R01MH079751 (PI: Ф. Перуцци) из Национального института психического здоровья. Содержания несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института психического здоровья и Национального института здоровья.
Materials
| Reagent | Concentration |
| Neurobasal | 98% |
| B27 | 2% |
| Glutamax | 0.5 mM |
Table I. Neurobasal/B27 complete medium.
| Reagent | Concentration |
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| NaCl | 160 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO2 | 0.22 mM |
| Gentamicin | 50 μg/ml |
| Fungizone | 250 ng/ml |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 320-330 mOsm |
Table II. Dissection medium.
| Reagent | Volume (μl) |
| Neurobasal/B27 complete medium | 240 |
| Trypan Blue Stain 0.4% | 250 |
| Total | 490 |
Table III. 50x Counting solution.
| Reagent | Company | Cat. number |
| Hibernate E | Brainbits | 767171 |
| Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
| B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
| Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
| Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G1264 |
| Glutamax 200 mM | Gibco, Invitrogen | 35050 |
| TrypLE Express w/o phenol red | Gibco, Invitrogen | 12604 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 |
| Laminin 1 mg/ml | Millipore | CC095 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Table IV. Specific reagents.
| Equipment | Company | Cat. number |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 |
| Large Forceps | FST | 11022-14 |
| Fine-tipped forceps | Moria | MC40B |
| Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 |
| Razor-sharp scissors | Roboz | RS-6820 |
| Micro Dissecting scissors | FST | 91460-11 |
| Micro Dissecting Curved scissors | FST | 14067-11 |
| Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 |
| 60 mm dishes | BD Falcon | 353002 |
| 100 mm dishes | Corning | 430167 |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352099 |
| 1.5 ml cryo-tube vial | Nunc | 375353 |
Table V. Specific equipment.
References
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing nerve cells. , (1998).
- Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
- Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
- Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).
