Isolering og dyrkning af Rotte Embryonale Neurale Celler: En hurtig protokol
Summary
Beskriver vi en hurtig metode til isolering og dyrkning hippocampale og corticale neuroner fra gnavere embryoer. Denne protokol tillader os at udføre eksperimenter, hvor næsten rene neuronale kulturer er påkrævet.
Abstract
Vi beskriver en hurtig metode til at dissociere og kultur hippocampus eller cortex neuroner fra E15-17 rotteembryoer. Fremgangsmåden kan anvendes med held til isolering af murine og humane primære neuroner og neurale stamceller. Dissocierede neuroner holdes i serumfrit medium i op til flere uger. Disse kulturer kan anvendes til nucleofection, immunocytokemi, Nucleic Acids præparat, såvel som elektrofysiologi. Ældre neuronale kulturer kan også transficeres med en god virkningsgrad ved lentiviral transduktion og mindre effektivt, med calciumphosphat eller lipid-baserede metoder, såsom lipofectamin.
Protocol
Discussion
Fremgangsmåden dissektion og kultur af rotte hippocampale og corticale neuroner beskrevet her tillader udførelse af eksperimenter med næsten rene neuronale kulturer dyrket i et kemisk defineret medium (figur 3). Selv protokoller for dyrkning af næsten rene neuroner i serum-frie medier er tidligere blevet beskrevet 2,3,4, der er vigtige ændringer i vores metode. Forskellig fra traditionelle protokoller (dvs. Banker et al.) 5, har vi erstattet trypsin med TrypLE Express, en mere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jonna Ellis til redaktionel assistance. Det beskrevne projekt blev støttet af Award Antal R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) fra National Institute of Mental Health. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Mental Health eller National Institutes of Health.
Materials
| Reagent | Concentration |
| Neurobasal | 98% |
| B27 | 2% |
| Glutamax | 0.5 mM |
Table I. Neurobasal/B27 complete medium.
| Reagent | Concentration |
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| NaCl | 160 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO2 | 0.22 mM |
| Gentamicin | 50 μg/ml |
| Fungizone | 250 ng/ml |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 320-330 mOsm |
Table II. Dissection medium.
| Reagent | Volume (μl) |
| Neurobasal/B27 complete medium | 240 |
| Trypan Blue Stain 0.4% | 250 |
| Total | 490 |
Table III. 50x Counting solution.
| Reagent | Company | Cat. number |
| Hibernate E | Brainbits | 767171 |
| Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
| B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
| Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
| Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G1264 |
| Glutamax 200 mM | Gibco, Invitrogen | 35050 |
| TrypLE Express w/o phenol red | Gibco, Invitrogen | 12604 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 |
| Laminin 1 mg/ml | Millipore | CC095 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Table IV. Specific reagents.
| Equipment | Company | Cat. number |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 |
| Large Forceps | FST | 11022-14 |
| Fine-tipped forceps | Moria | MC40B |
| Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 |
| Razor-sharp scissors | Roboz | RS-6820 |
| Micro Dissecting scissors | FST | 91460-11 |
| Micro Dissecting Curved scissors | FST | 14067-11 |
| Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 |
| 60 mm dishes | BD Falcon | 353002 |
| 100 mm dishes | Corning | 430167 |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352099 |
| 1.5 ml cryo-tube vial | Nunc | 375353 |
Table V. Specific equipment.
References
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing nerve cells. , (1998).
- Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
- Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
- Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).
