Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol
Summary
We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo's. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.
Abstract
We zijn het beschrijven van een snelle methode om zich te distantiëren en cultuur hippocampus of corticale neuronen van E15-17 rat embryo's. De procedure kan met succes worden toegepast voor de isolatie van muizen en menselijke primaire neuronen en neurale progenitoren. Los neuronen worden bijgehouden in serum-vrij medium tot enkele weken. Deze culturen gebruikt worden voor nucleofectie, immunocytochemie, nucleïnezuren bereiding en elektrofysiologie. Oudere neuronale kweken ook worden getransfecteerd met een goede rendement van lentivirale transductie en minder efficiënt, met calciumfosfaat of lipide-gebaseerde methoden zoals lipofectamine.
Protocol
Discussion
De werkwijze van ontleding en cultuur rat hippocampale en corticale neuronen beschreven kan uitvoeren experimenten met nagenoeg zuiver neuronale kweken gekweekt in een chemisch gedefinieerd medium (figuur 3). Hoewel protocollen voor het kweken van nagenoeg zuivere neuronen in serum-vrij medium zijn eerder beschreven 2,3,4 er belangrijke wijzigingen in onze methode. Anders dan de traditionele protocollen (dat wil zeggen Banker et al..) 5, hebben we vervangen door trypsine met TrypLE…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jonna Ellis voor de redactionele ondersteuning. Het beschreven project werd ondersteund door Award Aantal R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) van het National Institute of Mental Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute of Mental Health en de National Institutes of Health.
Materials
| Reagent | Concentration |
| Neurobasal | 98% |
| B27 | 2% |
| Glutamax | 0.5 mM |
Table I. Neurobasal/B27 complete medium.
| Reagent | Concentration |
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| NaCl | 160 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO2 | 0.22 mM |
| Gentamicin | 50 μg/ml |
| Fungizone | 250 ng/ml |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 320-330 mOsm |
Table II. Dissection medium.
| Reagent | Volume (μl) |
| Neurobasal/B27 complete medium | 240 |
| Trypan Blue Stain 0.4% | 250 |
| Total | 490 |
Table III. 50x Counting solution.
| Reagent | Company | Cat. number |
| Hibernate E | Brainbits | 767171 |
| Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
| B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
| Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
| Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G1264 |
| Glutamax 200 mM | Gibco, Invitrogen | 35050 |
| TrypLE Express w/o phenol red | Gibco, Invitrogen | 12604 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 |
| Laminin 1 mg/ml | Millipore | CC095 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Table IV. Specific reagents.
| Equipment | Company | Cat. number |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 |
| Large Forceps | FST | 11022-14 |
| Fine-tipped forceps | Moria | MC40B |
| Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 |
| Razor-sharp scissors | Roboz | RS-6820 |
| Micro Dissecting scissors | FST | 91460-11 |
| Micro Dissecting Curved scissors | FST | 14067-11 |
| Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 |
| 60 mm dishes | BD Falcon | 353002 |
| 100 mm dishes | Corning | 430167 |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352099 |
| 1.5 ml cryo-tube vial | Nunc | 375353 |
Table V. Specific equipment.
References
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing nerve cells. , (1998).
- Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
- Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
- Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).
