في الوقت الحقيقي التصوير الرقمي من خلايا الدم البيضاء البطاني التفاعل في الإسكيمية-ضخه من الإصابات (IRI) في الجرذان العضلة المشمرة
Summary
الرقمية intravital المجهري epifluorescence من الوريدات شعيرة وريدية في دوران الأوعية الدقيقة مشمري هو وسيلة مريحة للحصول على نظرة ثاقبة الكريات البيض البطاني تفاعل<em> في الجسم الحي</em> في الإسكيمية-ضخه الاصابة (IRI) من الأنسجة العضلية المخططة. ونحن نقدم هنا بروتوكولا مفصلة لتنفيذ بأمان تقنية ومناقشة تطبيقاتها والقيود.
Abstract
وقد تورط الإسكيمية-ضخه الاصابة (IRI) في مجموعة كبيرة من الحالات المرضية مثل السكتة الدماغية الدماغ، احتشاء عضلة القلب، نقص تروية الأمعاء، وكذلك بعد عملية زرع القلب والأوعية الدموية، وجراحة إعادة إشباع الخلايا 1. من الأنسجة الدماغية في السابق، في حين أساسي للوقاية من لا رجعة فيه إصابة الأنسجة، يتسبب التهاب الزائدة من الأنسجة المتضررة. المتاخمة لإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، تفعيل نظام مكمل وزيادة نفاذية الاوعية الدموية الدقيقة، وتنشيط الكريات البيض من هو واحد من الأطراف الفاعلة المبدأ في سلسلة من تلف الأنسجة المرضية للالتهابات خلال ضخه. 2، 3 تنشيط خلايا الدم البيضاء هي عملية متعددة الخطوات التي تتكون من المتداول، التصاق وطيد والتهجير وبوساطة تفاعل معقد بين جزيئات الالتصاق ردا على chemoattractants مثل عوامل مكملة، كيموكينات، أو عامل الصفيحات تفعيل-4
<ف الطبقة = "jove_content"> وفي الوقت الذي توسط في الغالب المتداول الكريات البيض في الأوردة شعيرة وريدية بواسطة تفاعل selectins 5 مع يغاندس وما يماثلها، التصاق الكريات البيض من شركة إلى البطانة غير selectin التي تسيطر عليها عن طريق ملزمة لجزيئات الالتصاق بين الخلايا (ICAM) والخليوي وعائي جزيئات الالتصاق (VCAM). 6، 7معيار الذهب للمراقبة في الجسم الحي من الكريات البيض البطاني التفاعل تقنية المجهر intravital، لأول مرة في عام 1968. 8
على الرغم من وصفت نماذج مختلفة من المعهد الجمهوري الدولي (نقص التروية، ضخه الاصابة) لمختلف الأجهزة، 9-12 قليلة فقط هي مناسبة لرؤية مباشرة من تجنيد الكريات البيض في قاع الاوعية الدموية الدقيقة على مستوى عال من جودة الصورة. 8
نحن هنا لتعزيز رقمي المجهري epifluorescence intravital من الوريد شعيرة وريدية في دوران الأوعية الدقيقة مشمريمن الفئران 13 كوسيلة من وسائل مريحة لنوعيا وكميا تحليل تجنيد الكريات البيض عن المعهد الجمهوري الدولي للبحوث في الأنسجة العضلية المخططة وتوفير دليل مفصل لإنجاز تقنية. نحن لتوضيح مزيد من المخاطر المشتركة وتقديم النصائح المفيدة التي ينبغي أن تمكن القارئ أن نقدر حقا، وآمن طريقة أداء.
في خطوة من قبل بروتوكول خطوة نقوم تصور كيف تبدأ مع تخدير تنفس تسيطر عليها تحت مراقبة كافية للحفاظ على الحيوانات تخدير بحزم لفترات أطول من الوقت. وصفنا ثم إعداد ورقة مشمري كما شقة رقيقة لقرار الضوئية المعلقة وتوفير بروتوكول للتصوير الكريات البيض في المعهد الجمهوري الدولي الذي تم راسخة في مختبراتنا.
Protocol
Discussion
الكريات البيض البطاني تفاعل وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية وتفعيل نظام المتممة هي الملامح الرئيسية لضعف الأنسجة IRI التي يسببها. يعتبر دوران الأوعية الدقيقة (26) من الأنسجة المتضررة، في موقع لا يتجزأ عن ظهور التهابات. وبصرف النظر عن التجارب المجراة سابقا م…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من "جمعية الألمانية للبحوث" لأيزينهارت SU (EI 866/1-1).
Materials
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 – A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32×32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).
- Lazarus, B. The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 191, 443-448 (2000).
- van den Heuvel, M. G. Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).
- Rosen, S. D. Cell surface lectins in the immune system. Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).
- van der Flier, A., Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).
- Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Sutton, T. A. Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).
- Serracino-Inglott, F. Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion. Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).
- Eppinger, M. J. Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung. Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).
- Dumont, E. A. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart. Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Woeste, G. Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia. Transplantation. 86, 961-967 (2008).
- Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart. Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).
- Dobschuetz, E. v. o. n. Dynamic intravital fluorescence microscopy–a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).
- Vutskits, L. Adverse effects of methylene blue on the central nervous system. Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).
- Takasu, A. Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats. J. Trauma. 8, 312-316 (2010).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2874 (2011).
- Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).
- Leoni, G. Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion. FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).
- Simoncini, T. Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature. 407, 538-541 (2000).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Mori, N. Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice. Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).
- Eisenhardt, S. U. Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples. Ann. Plast. Surg. , (2011).
- Eisenhardt, S. U. Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents. Blood. 109, 3521-3528 (2007).
- Eisenhardt, S. U. Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques. Circ Res. 105, 128-137 (2009).
- Eisenhardt, S. U. C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties. Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).
- Granger, D. N. . Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , 520 (1995).
- Baatz, H. Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).
