Raman-spektroskopi er en egnet teknik til berøringsfri, etiketten uden analyse af levende celler, væv fremstillede konstruktioner og native væv. Kilde-specifikke spektrale fingeraftryk kan genereres og analyseres ved hjælp af multivariabel analyse.
Ikke-destruktiv, ikke-kontakt og etiket-fri teknologier til overvågning celle-og vævskulturer er behov for inden for biomedicinsk forskning. 1-5 imidlertid for tiden tilgængelige rutinemæssige fremgangsmåder kræver bearbejdningstrin og ændre prøve integritet. Raman-spektroskopi er en hurtig fremgangsmåde, der muliggør måling af biologiske prøver uden behov for yderligere bearbejdningstrin. . Denne laser-baseret teknologi detekterer uelastisk spredning af monokromatisk lys 6 Da hvert kemikalie vibration er tildelt en specifik Raman-bånd (bølgetal i cm-1), idet hver biologisk prøve indeholder et typisk spektral mønster på grund af deres iboende biokemisk sammensætning 7. – 9 Inden Raman spektre, topintensiteterne korrelerer med mængden af de nuværende molekylære bindinger. 1. Ligheder og forskelle i de spektrale datasæt kan påvises ved at anvende en multivariat analyse (fx principal komponent analyse (PCA)). 10 </sup>
Her udfører vi Raman spektroskopi af levende celler og indfødte væv. Cellerne er enten podet på glasbund skåle eller holdes i suspension under normale cellekultur betingelser (37 ° C, 5% CO 2) før måling. Native væv dissekeres og lagres i phosphatpufret saltvand (PBS) ved 4 ° C før måling. Afhængig af vores eksperimentelle opsætning, så vi enten fokuseret på cellekernen eller ekstracellulær matrix (ECM) proteiner såsom elastin og kollagen. For alle undersøgelser, er mindst 30 celler eller 30 tilfældige steder af interesse inden for ECM målt. Databehandling trin inkluderet baggrundssubtraktion og normalisering.
Raman-spektroskopi er en egnet værktøj til analyse af biologiske prøver, såsom in vitro-dyrkede celler og ECM-proteiner såvel som celler i native væv. 11,15,16 Her har vi demonstreret, at denne ikke-kontakt etiket-fri teknik tillader diskrimination af forskellige celletyper og påvisning af ECM protein nedbrydning udelukkende baseret på den iboende biomolekylære sammensætningen af disse biologiske prøver.
Den største fordel ved Raman spektroskopi er evnen til ikke-invasivt kvantificere biokemiske fingeraftryk af en prøve af den resulterende Raman-spektre. I modsætning til infrarød spektroskopi, hvilket giver lignende information kan Raman-spektre opsamles fra vandige prøver, som Raman spredning af vand er svag. Desuden er Raman spektroskopi udelukkende baseret på påvisning af tilbagespredning af monokromatisk lys, og derfor er ingen prøve behandling, som kræves før måling. Disse egenskaber gør Ramand spektroskopi et lovende alternativ til potentiel in vivo billeddannelse anvendelser. I denne forbindelse, er sammenhængende anti-Stokes Raman spektroskopi (CARS) en meget interessant teknik, da det gør det hurtigere og mere følsomme erhvervelse af data baseret på de samme vibrationelle signaler anvendes i vores eksperimenter. 15,16 Andre alternative metoder, herunder multiphoton-induceret autofluorescens og anden harmoniske generation billeddannelse er tidligere blevet vist at være egnede til monitorering af biologiske prøver uden eller med minimal invasiv. 17 imidlertid er disse afbildningsmodaliteter forbundet med meget høje omkostninger og er begrænset til autofluorescens-genererende molekyler. Desuden er Raman spektrometer let at kombinere med konventionelle optiske mikroskoper. Disse egenskaber gør Raman spektroskopi et værdifuldt værktøj til at studere biologiske prøver i fysiologiske miljøer.
En af de nuværende begrænsninger i vores Raman spektroskopi oprettet erDen relativt lille Laser Focus (250 nm fuld bredde halvt maksimum (FWHM) lateral og 700 nm FWHM aksial), der er skabt af en høj numerisk apertur mål (NA = 1,2). Selv om en høj numerisk apertur tillader at dække en god mængde af det udsendte Raman lys giver i et højt signal-støjforhold, høj NA frembringer kun en lille samling fokus i prøven, som typisk er meget mindre end en celle. For at sammenligne Raman-spektre af forskellige celler, tapning af en repræsentativ spektrum er væsentligt, hvilket er vanskeligt at opnå med en lille fokusområde. For at løse dette problem, vi arbejder på en proces for at automatisere signalet indsamlingen på forskellige punkter i cellen (= Raman spektroskopiske kortlægning), hvilket resulterer i en spektral gennemsnit og giver til et repræsentativt spektrum. Derudover vil denne teknik giver et overblik over fordelingen af specifikke Raman-bånd, for eksempel af proteinet fordeling i en celle.
Biological prøver er meget komplekse og består af en heterogen blanding af biomolekyler, der bidrager til samlet Raman-spektre. Derfor spektrale mønster er meget kompleks, og overvågning af en enkelt type af et molekyle i et Raman-spektrum er vanskelig at opnå med overlapning af de forskellige molekyle signaler. Desuden kan iboende fluorescens af prøven maskere værdifuld information svagere Raman signaler. Interessant nok i nogle af vores tidligere undersøgelser, identificerede vi autofluorescens i Raman spektre som den vigtigste differentierende faktor mellem celletyper (MSC og fibroblaster) ved hjælp af en relevant analyse værktøj. 13 Vi har også konstateret, at ændringer i den overordnede Raman signalintensitet kan tjene som en indikator for tilstanden af kollagen og kollagen fibre i ECM af aortaklapflige. 9 Men når man analyserer tilstanden af elastin i disse væv, var vi ikke i stand til at registrere tilsvarende resultater. Som nævnt i det resultats sektion vi kun var i stand til at detektere ændringer i specifikke Raman-bånd i elastase-behandlede prøver sammenlignet med de native kontroller. Vi kunne ikke se et fald i den samlede Raman signal i de enzymatisk-behandlede prøver som forventet. Disse observationer resulterede i en score plot, der ikke klart viser en klynge formation som vist i den tidligere undersøgelse. 9 I modsætning hertil blev indflydelsen af den enzymatiske behandling kan påvises inden for PCA resultater. Vi antager, at forskellene mellem de to ECM-proteiner, elastin og collagen, er baseret på morfologiske forskelle og forskellige enzymatiske nedbrydningsprodukter processer: i aortaklappen folder er collagen-rige zone (fibrosa) et kontinuert lag, der bliver løsnet på grund af enzymatisk behandling, hvorved elastin indeholdende zone (ventricularis) har en netværkskonfiguration der vises fragmenteret efter udsættelse for elastase (fig. 4). Enkelte punktmålinger var derfor ikke hensigtsspiste for at opdage sådanne små bristninger i elastin netværket. Her ville en Raman kortlægning af vævet hjælpe med at identificere nedbrud.
En yderligere udfordring i Raman spektroskopi af biologiske prøver, er at reducere måletidspunkter. En løsning er at forøge lasereffekt, der er egnet, så længe de biologiske prøver ikke er påvirket af foto-beskadigelse. Alle vores nuværende eksperimenter er proof-of-principle undersøgelser, der fokuserer på grundforskning, men vores overordnede mål er at gennemføre Raman spektroskopi til kliniske anvendelser, herunder regenerativ medicin (f.eks kvalitetskontrol af væv-manipuleret), præ-transplantation graft overvågning og kræftdiagnostik.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Steffen Koch for hans teknisk support og Shannon Lee Layland (både Fraunhofer IGB Stuttgart) for hans nyttige forslag til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Tiltrække program Fraunhofer-Gesellschaft og BMBF (både til KS-L.).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
elastase | Worthington | LS006363 | |
anti-elastin antibody | Sigma | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
PBS | Lonza | 17-512F | |
glass bottom dishes | Greiner BioOne | 627860 | |
The Unscrambler | CAMO | ||
Opus | Bruker |