रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी गैर संपर्क, जीवित कोशिकाओं, ऊतक इंजीनियर constructs और देशी ऊतकों का लेबल मुक्त विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त तकनीक है. विशेष वर्णक्रमीय उँगलियों के निशान और उत्पन्न किया जा सकता है बहुभिन्नरूपी विश्लेषण का उपयोग विश्लेषण.
गैर विनाशकारी, गैर संपर्क और लेबल से मुक्त करने के लिए सेल और ऊतक संस्कृतियों की निगरानी प्रौद्योगिकियों जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में की जरूरत है 1-5 हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध दिनचर्या तरीकों प्रसंस्करण कदम की आवश्यकता होती है और नमूना अखंडता बदल. रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी एक तेजी से विधि है कि आगे प्रसंस्करण कदम के लिए जरूरत के बिना जैविक नमूने का माप सक्षम बनाता है. इस प्रौद्योगिकी लेजर आधारित रंग का प्रकाश की बेलोच बिखरने का पता लगाता है 6 के रूप में हर रासायनिक कंपन के एक विशिष्ट रमन बैंड (सेमी में wavenumber -1) को सौंपा है, प्रत्येक जैविक नमूने एक ठेठ वर्णक्रमीय अपने निहित जैव रासायनिक संरचना के कारण पैटर्न सुविधाएँ 7. रमन स्पेक्ट्रा के भीतर 9, शिखर तीव्रता वर्तमान आणविक बांड की राशि के साथ सहसंबंधी एक समानता और वर्णक्रमीय डेटा सेट के मतभेद एक बहुभिन्नरूपी विश्लेषण रोजगार (जैसे प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए)) के द्वारा पाया जा सकता है. 10. </sup>
यहाँ, हम जीवित कोशिकाओं और देशी ऊतकों की रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का प्रदर्शन करते हैं. कोशिकाओं या तो गिलास नीचे बर्तन पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं या सामान्य सेल संस्कृति शर्तों के तहत निलंबन में रखा (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) माप से पहले. देशी ऊतकों विच्छेदित कर रहे हैं और फॉस्फेट में संग्रहीत खारा 4 डिग्री सेल्सियस पूर्व माप में (पीबीएस) बफर. हमारी प्रयोगात्मक सेट पर निर्भर करता है, हम तो या तो सेल नाभिक या elastin और कोलैजेन के रूप में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित. सभी पढ़ाई के लिए, 30 कोशिकाओं या ECM के भीतर ब्याज के 30 यादृच्छिक अंक की एक न्यूनतम मापा जाता है. डाटा प्रोसेसिंग कदम पृष्ठभूमि घटाव और सामान्य.
रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी इन विट्रो सुसंस्कृत देशी ऊतकों के भीतर कोशिकाओं और ईसीएम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन कोशिकाओं में इस तरह के रूप में जैविक नमूने, विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त उपकरण है 11,15,16 यहाँ, हम दिखा दिया है कि इस गैर संपर्क, लेबल मुक्त तकनीक की अनुमति देता है विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के भेदभाव और ईसीएम प्रोटीन गिरावट केवल इन जैविक नमूने की आंतरिक biomolecular संरचना पर आधारित का पता लगाने.
रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का प्रमुख लाभ गैर invasively इसके परिणामस्वरूप रमन स्पेक्ट्रा से एक नमूना की जैव रासायनिक अंगुलांक यों क्षमता है. अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी, जो इसी तरह की जानकारी पैदावार के विपरीत, रमन स्पेक्ट्रा से जलीय नमूने से एकत्र किया जा सकता है, पानी से रमन बिखराव के रूप में कमजोर है. इसके अलावा, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी केवल एक रंग का प्रकाश की backscattering का पता लगाने पर आधारित है, इसलिए, कोई नमूना प्रसंस्करण पूर्व माप की आवश्यकता है. इन विशेषताओं रा बनानाआदमी स्पेक्ट्रोस्कोपी vivo इमेजिंग अनुप्रयोगों में क्षमता के लिए एक आशाजनक विकल्प. इस संबंध में सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (कार) एक बहुत ही दिलचस्प तकनीक है क्योंकि यह तेजी से और सक्षम बनाता है वही कंपन हमारे प्रयोगों में उपयोग संकेतों के आधार पर डेटा की अधिक संवेदनशील अधिग्रहण 15,16 multiphoton प्रेरित autofluorescence सहित अन्य वैकल्पिक तरीकों. और दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी इमेजिंग पहले किया गया है गैर या कम से कम invasively जैविक नमूने की निगरानी के लिए उपयुक्त होना सिद्ध 17 हालांकि, इन इमेजिंग रूपात्मकता बहुत उच्च लागत के साथ जुड़े रहे हैं. और autofluorescence पैदा अणुओं के लिए सीमित कर रहे हैं. इसके अलावा, रमन स्पेक्ट्रोमीटर पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ गठबंधन करने के लिए आसान है. इन विशेषताओं रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी शारीरिक वातावरण में जैविक नमूनों के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाते हैं.
हमारे रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी की वर्तमान सीमाओं में से एक सेट हैअपेक्षाकृत छोटे लेजर (250 एनएम पूर्ण चौड़ाई आधा (FWHM) अधिकतम पार्श्व और 700 एनएम FWHM अक्षीय) ध्यान केंद्रित है कि एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य (एनए = 1.2) के द्वारा बनाया जाता है. हालांकि एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उत्सर्जित रमन प्रकाश एक उच्च संकेत से शोर अनुपात में उपज का एक अच्छा राशि को कवर करने की अनुमति देता है, उच्च एनए ही नमूना है कि आम तौर पर अधिक एक सेल की तुलना में छोटे के भीतर एक छोटे से संग्रह ध्यान केंद्रित पैदा करता है. आदेश में विभिन्न कोशिकाओं के रमन स्पेक्ट्रा तुलना करने के लिए, एक प्रतिनिधि स्पेक्ट्रम का संग्रह आवश्यक है, जो एक छोटे से फोकस क्षेत्र के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है. इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम करने के लिए एक कक्ष के भीतर विभिन्न बिंदुओं (= रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी मानचित्रण), एक औसत और एक प्रतिनिधि स्पेक्ट्रम उपज वर्णक्रमीय में जिसके परिणामस्वरूप के संकेत संग्रह को स्वचालित प्रक्रिया पर काम कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, इस तकनीक का एक कोशिका के भीतर प्रोटीन वितरण के उदाहरण के लिए विशिष्ट रमन बैंड के वितरण की एक सिंहावलोकन प्रदान करेगा.
बॉयogical नमूने अत्यधिक जटिल कर रहे हैं और biomolecules कि एकत्र रमन स्पेक्ट्रा के लिए योगदान की एक विषम मिश्रण से मिलकर बनता है. इसलिए, वर्णक्रमीय पैटर्न बेहद जटिल है और एक रमन स्पेक्ट्रम के भीतर एक अणु का एक प्रकार की निगरानी के लिए अलग अणु संकेतों के अतिव्यापी के साथ पूरा करने के लिए मुश्किल है. इसके अतिरिक्त, नमूना के आंतरिक प्रतिदीप्ति कमजोर रमन संकेत का मूल्यवान जानकारी मुखौटा हो सकता है. दिलचस्प है, हमारे अध्ययन के पिछले कुछ में, हम रमन स्पेक्ट्रा में autofluorescence मुख्य कक्ष (MSCs और fibroblasts) के प्रकार के एक उचित विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर के बीच फर्क कारक के रूप में 13 की पहचान की. हम भी पहचान की है कि समग्र रमन संकेत तीव्रता में परिवर्तन के रूप में सेवा कर सकते हैं कोलेजन और महाधमनी वाल्व पत्रक के ईसीएम भीतर कोलेजन फाइबर के राज्य के लिए एक सूचक है. 9 हालांकि, जब इन ऊतकों में elastin के राज्य का विश्लेषण, हम इसी तरह के परिणाम का पता लगाने में सक्षम नहीं थे. परिणाम के रूप में वर्णितअनुभाग, हम केवल इलास्टेज इलाज के नमूने में विशिष्ट रमन बैंड के परिवर्तन का पता लगाने के जब देशी नियंत्रण की तुलना में सक्षम थे. हम enzymatically इलाज के नमूने के रूप में की उम्मीद में समग्र रमन संकेत की कमी नहीं देखा था. इन टिप्पणियों को एक अंक साजिश है कि एक स्पष्ट क्लस्टर गठन प्रकट नहीं के रूप में पिछले अध्ययन में देखा था इसके विपरीत 9 के परिणामस्वरूप, एंजाइमी उपचार के प्रभाव पीसीए परिणाम के भीतर detectable था. हम मानते हैं कि दो ईसीएम प्रोटीन, elastin और कोलैजेन के बीच इन विसंगतियों रूपात्मक मतभेद और अलग एंजाइमी गिरावट प्रक्रियाओं पर आधारित होते हैं: महाधमनी वाल्व पत्रक के भीतर, कोलेजन युक्त क्षेत्र (fibrosa) के एक सतत परत है कि कारण ढीला हो जाता है एंजाइमी उपचार, elastin के क्षेत्र (ventricularis) युक्त एक संजाल विन्यास के लिए जोखिम इलास्टेज छवि (4) के बाद खंडित दिखाई देता है जिससे है. एकल स्थान के माप इसलिए उपयुक्त नहीं थेelastin के नेटवर्क के भीतर इस तरह के छोटे ruptures का पता लगाने के लिए खाया. यहाँ, ऊतक के एक रमन मानचित्रण के लिए नेटवर्क के टूटने की पहचान में मदद मिलेगी.
जैविक नमूनों की रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी में एक और चुनौती माप समय कम है. एक समाधान के लिए लेजर शक्ति है, जो जब तक के रूप में जैविक नमूने तस्वीर क्षति से प्रभावित नहीं हैं के रूप में उपयुक्त है वृद्धि हुई है. हमारे वर्तमान प्रयोगों के सभी सबूत के सिद्धांत के बुनियादी अनुसंधान पर ध्यान केंद्रित अध्ययन कर रहे हैं, लेकिन, हमारे समग्र लक्ष्य के लिए पुनर्योजी चिकित्सा (उदाहरण के लिए ऊतक इंजीनियर उत्पादों की गुणवत्ता नियंत्रण), पूर्व प्रत्यारोपण भ्रष्टाचार निगरानी और सहित नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी लागू है कैंसर निदान.
The authors have nothing to disclose.
हम अपने तकनीकी सहायता और शान्नोन ली Layland (स्टटगार्ट दोनों Fraunhofer IGB) के लिए पांडुलिपि पर अपने उपयोगी सुझाव के लिए Steffen कोच धन्यवाद. यह काम आर्थिक रूप से आकर्षित Fraunhofer-Gesellschaft, और BMBF (एस एल.) के कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
elastase | Worthington | LS006363 | |
anti-elastin antibody | Sigma | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
PBS | Lonza | 17-512F | |
glass bottom dishes | Greiner BioOne | 627860 | |
The Unscrambler | CAMO | ||
Opus | Bruker |