गैर संपर्क, सेल और बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग करते हुए रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का लेबल मुक्त निगरानी

Summary

रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी गैर संपर्क, जीवित कोशिकाओं, ऊतक इंजीनियर constructs और देशी ऊतकों का लेबल मुक्त विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त तकनीक है. विशेष वर्णक्रमीय उँगलियों के निशान और उत्पन्न किया जा सकता है बहुभिन्नरूपी विश्लेषण का उपयोग विश्लेषण.

Abstract

गैर विनाशकारी, गैर संपर्क और लेबल से मुक्त करने के लिए सेल और ऊतक संस्कृतियों की निगरानी प्रौद्योगिकियों जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में की जरूरत है ^1-5 हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध दिनचर्या तरीकों प्रसंस्करण कदम की आवश्यकता होती है और नमूना अखंडता बदल. रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी एक तेजी से विधि है कि आगे प्रसंस्करण कदम के लिए जरूरत के बिना जैविक नमूने का माप सक्षम बनाता है. इस प्रौद्योगिकी लेजर आधारित रंग का प्रकाश की बेलोच बिखरने का पता लगाता है ⁶ के रूप में हर रासायनिक कंपन के एक विशिष्ट रमन बैंड (सेमी में wavenumber ^-1) को सौंपा है, प्रत्येक जैविक नमूने एक ठेठ वर्णक्रमीय अपने निहित जैव रासायनिक संरचना के कारण पैटर्न सुविधाएँ ^7. रमन स्पेक्ट्रा के भीतर ^9, शिखर तीव्रता वर्तमान आणविक बांड की राशि के साथ सहसंबंधी ^एक समानता और वर्णक्रमीय डेटा सेट के मतभेद एक बहुभिन्नरूपी विश्लेषण रोजगार (जैसे प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए)) के द्वारा पाया जा सकता है. ^10. </sup>

यहाँ, हम जीवित कोशिकाओं और देशी ऊतकों की रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का प्रदर्शन करते हैं. कोशिकाओं या तो गिलास नीचे बर्तन पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं या सामान्य सेल संस्कृति शर्तों के तहत निलंबन में रखा (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ ₂₎ माप से पहले. देशी ऊतकों विच्छेदित कर रहे हैं और फॉस्फेट में संग्रहीत खारा 4 डिग्री सेल्सियस पूर्व माप में (पीबीएस) बफर. हमारी प्रयोगात्मक सेट पर निर्भर करता है, हम तो या तो सेल नाभिक या elastin और कोलैजेन के रूप में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित. सभी पढ़ाई के लिए, 30 कोशिकाओं या ECM के भीतर ब्याज के 30 यादृच्छिक अंक की एक न्यूनतम मापा जाता है. डाटा प्रोसेसिंग कदम पृष्ठभूमि घटाव और सामान्य.

Protocol

1. जैविक नमूना की तैयारी जीवित कोशिकाओं की तैयारी पक्षपाती कोशिकाओं की तैयारी एक गिलास नीचे (Greiner BioOne / जर्मनी) पकवान और 37 में उन्हें सेते हैं पर इन विट्रो सुसंस्कृत या हौसले से अलग कक्षों में बीज डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 तक सेल लगाव पूरा हो गया है. संस्कृति के माध्यम को निकालें और पीबीएस पूर्व माप के साथ धीरे तीन बार धोना. पूरे माप प्रक्रिया में या तो पीबीएस या सेल संस्कृति माध्यम के साथ कवर कोशिकाओं रखें. कोशिकाओं के निलंबन में तैयारी आम प्रोटोकॉल (जैसे trypsin EDTA, सेल scraping) के अनुसार इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं को अलग करें, कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और पीबीएस में प्राप्त सेल गोली या सेल संस्कृति माध्यम फिर से निलंबित. एक गिलास नीचे डिश के लिए स्थानांतरण: सेल निलंबन के 100 μl (अधिकतम 100,000 सेल / एमएल एकाग्रता). सर्वर% s में सेट तैयारive के ऊतकों ऊतकों कटाई के बाद उन्हें बाँझ, बहुत ठंडा पीबीएस हस्तांतरण और उन्हें डिग्री सेल्सियस 4 या बर्फ पूर्व माप पर 12 घंटे से अधिक नहीं रह रखना. पिछले प्रयोगों से पता चला है कि एक लंबे समय तक भंडारण समय (ठंड ischemia समय> 12 डिग्री सेल्सियस 4 घंटे) वर्णक्रमीय प्राकृतिक गिरावट प्रक्रियाओं के कारण परिवर्तन के परिणामस्वरूप. माप पीबीएस या मध्यम में शामिल ऊतक को ईसीएम प्रोटीन और कोशिकाओं ऊतक सुखाने के लिए कारण के नुकसान से बचने के साथ किया जाना चाहिए. 2. रमन स्पेक्ट्रोमीटर हमारे अनुकूलित रमन स्पेक्ट्रोमीटर रमन स्पेक्ट्रोमीटर रमन स्पेक्ट्रा के साथ उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवियों के प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है के साथ एक मानक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन (ओलिंप नौवीं 71) को जोड़ती है. बुनियादी सेट अप एक 784 एनएम डायोड लेजर (Toptica फोटोनिक्स एजी / जर्मनी), रमन – बिखरे उत्तेजना प्रकाश से प्रकाश की जुदाई के लिए एक पायदान फिल्टर, एक खुर्दबीन के होते हैंएन डी spectrograph (कैसर ऑप्टिकल सिस्टम्स इंक, एन आर्बर / संयुक्त राज्य अमेरिका) के साथ एक प्रभारी युग्मित डिवाइस (सीसीडी कैमरा) वर्णक्रमीय जानकारी (शीतल इमेजिंग सिस्टम / जर्मनी से एफ देखने के लिए) का पता लगाने के लिए अनुकूलित है. 3. लेजर समारोह का नियंत्रण सॉफ्टवेयर Andor Solis (Andor किंगडम / संयुक्त) प्रारंभ और सीसीडी कैमरे का तापमान -60 करने के लिए सेट डिग्री सेल्सियस कैमरे में thermally प्रेरित धाराओं की वजह से शोर को कम करने. खुर्दबीन मंच पर अंशांकन प्रक्रिया के लिए एक सिलिकॉन वफ़र रखें. मुड़ें पर लेजर और 85 मेगावाट बिजली सेट. सेल बी (/ ओलिंप जर्मनी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए वफ़र पर लेजर ध्यान केंद्रित तक XY प्रकट होता है. 1 सेकंड की एक एकीकरण के समय एक 60x हवा उद्देश्य का उपयोग कर के साथ सिलिकॉन वफ़र उपाय. पिक्सेल संख्या से Andor सोलिस सॉफ्टवेयर में रमन बदलाव (-1 सेमी) x-अक्ष की इकाई बदलें. 520 सेमी -1 में सिलिकॉन चोटी के लेजर ध्यान केंद्रित भिन्न होस्पेक्ट्रम एकत्र क्रम में यह रमन बैंड के लिए अधिकतम संभव तीव्रता. मायने रखता है की न्यूनतम राशि 11,000 से अधिक हो सकता है एक सफल अंशांकन चाहिए. 4. रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी माप सभी मापन कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं. मूल सेटिंग्स 1.2 के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 60x पानी के विसर्जन के उद्देश्य (/ ओलिंप जर्मनी) का उपयोग करने के लिए नमूने के स्पेक्ट्रम इकट्ठा. माप 100 प्रति सेकंड के कुल के लिए 10 एकीकरण / 10 सेकंड के लिए अधिग्रहण सेटिंग्स बदलें. पक्षपाती कोशिकाओं का मापन कोशिकाओं के साथ गिलास नीचे पकवान ले लो और यह खुर्दबीन मंच पर जगह है. आदेश में प्राप्त करने के लिए एक बेहतर संकेत और reproducibility सुनिश्चित करने, सेल नाभिक पर लेजर ध्यान केंद्रित करने के लिए, खुर्दबीन प्रकाश बंद और स्पेक्ट्रम का संग्रह शुरू. पृष्ठभूमि ई के संदर्भ स्पेक्ट्रम उपायबहुत कक्ष के बगल में लेजर ध्यान केंद्रित हिल द्वारा 10 स्पेक्ट्रा. यह महत्वपूर्ण है कि जब ध्यान केंद्रित बदल रहा है एक नया पृष्ठभूमि प्रत्येक ध्यान केंद्रित गहराई के लिए एकत्र किया जाना चाहिए पर विचार करने के लिए. कोशिकाओं के निलंबन में मापन गिलास नीचे डिश में सेल निलंबन के 100 μl स्थानांतरण और यह खुर्दबीन मंच पर जगह है. सेल के केंद्र पर लेजर फोकस, खुर्दबीन प्रकाश बंद और स्पेक्ट्रम का संग्रह शुरू करते हैं. सेल के बगल में लेजर ध्यान केंद्रित चलती पृष्ठभूमि के संदर्भ स्पेक्ट्रम हर 10 स्पेक्ट्रा उपाय. जब ध्यान केंद्रित बदल रहा है, एक नया पृष्ठभूमि नए ध्यान की गहराई के लिए एकत्र किया जाना चाहिए. देशी ऊतकों का मापन नमूना ले लो और एक गिलास नीचे पकवान में जगह है. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र उन्मुख हो सकता है पकवान के नीचे का सामना करना चाहिए. नमूना कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस के साथ पकवान भरें. नमूना पर एक कवर ग्लास प्लेस से बचने के किसी भी बढ़नमूना के मापन के दौरान ement. ब्याज की संरचना में लेजर ध्यान केंद्रित सेट (गहराई संकल्प लेजर और ऊतक पर निर्भर है) और स्पेक्ट्रा एकत्रित शुरू. लेजर पूरे ऊतकों क्षेत्र के बाहर ध्यान केंद्रित चलती पृष्ठभूमि के संदर्भ स्पेक्ट्रम हर 10 स्पेक्ट्रा लीजिए. जब ध्यान केंद्रित बदल रहा है, एक नया पृष्ठभूमि नए ध्यान की गहराई के लिए एकत्र किया जाना चाहिए. Immunofluorescence की माप (यदि)-लेबल cryosections, अनुभाग ताजा, तस्वीर जमी ऊतक के नमूने का उपयोग कर एक मानक cryotom है और उन्हें सिलिका में लिपटे कवर चश्मे पर माउंट. यदि हां, केवल एक छोटी नियतन कदम (अधिकतम 4% paraformaldehyde के साथ 10 मिनट) रोजगार और ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए एक नियमित प्रोटोकॉल के बाद cryosections दाग. रमन क्षेत्र जहां प्रतिदीप्ति होता है है में ध्यान केंद्रित मापन का प्रदर्शन. Elastin गिरावट प्रयोगों पीएलएCE के विच्छेदित सुअर का महाधमनी वाल्व पत्रक (elastin के अमीर, रक्त हृदय वाल्व पत्रक के इनफ्लो की ओर परत) गिलास नीचे पकवान के नीचे का सामना करने की ventricularis. पूरे ऊतक तंतुमय संरचनाओं में ध्यान केंद्रित सतह भर में 30 यादृच्छिक अंक में 'गैर incubated नियंत्रण' के रूप में मूल ऊतक उपाय. नमूना 3 वर्गों में विभाजित और अलग 2.5 मिलीलीटर Eppendorf इलास्टेज समाधान (5 यू / एमएल / वोर्थिन्ग्तों जर्मनी) के 2 मिलीग्राम से भरा ट्यूबों में उन्हें जगह है. ऊतक सेते हैं या तो 15 या 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस या तो 15 या 30 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद, Eppendorf ट्यूब से ऊतकों को हटाने और पीबीएस के साथ सावधानी से धोने के क्रम में पूरी तरह से एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकने के. 30 यादृच्छिक बिंदुओं पर प्रत्येक नमूने के उपाय, तंतुमय संरचनाओं में ध्यान केंद्रित. 5. डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण रमन स्पेक्ट्रा प्रसंस्करण के पूर्व उपचारउत्पन्न स्पेक्ट्रा रचना सॉफ्टवेयर (Bruker है Optik GmbH / जर्मनी) का उपयोग किया गया था. आदेश में कांच और माध्यम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हस्तक्षेप संकेतों को कम करने के लिए माप के दौरान ध्यान में परिवर्तन की वजह से विविधताओं से बचने के, एकत्र स्पेक्ट्रा से इसी पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम घटाना. स्पेक्ट्रा को को 400-1800 -1 सेमी है, जो जानकारी के उच्चतम राशि प्रदान करता है के बीच wavenumber क्षेत्र के लिए कम करें. यदि आवश्यक हो, अधिकतम पीक करने के लिए के स्पेक्ट्रा सामान्य. तीव्रता उतार चढ़ाव और व्यवस्थित विफलताओं, नमूना स्पेक्ट्रा में संरचनात्मक परिवर्तन का पता लगाने को सरल बनाने के बाहर सामान्य है कारकों. आधारभूत सुधार कर विभिन्न प्रयोगों के बीच तुलनीयता बढ़ाने के लिए. रमन स्पेक्ट्रा विश्लेषण रमन स्पेक्ट्रा Unscrambler सॉफ्टवेयर (/ CAMO नॉर्वे) के साथ पीसीए का उपयोग विश्लेषण किया गया. इस बहुभिन्नरूपी विश्लेषण वर्णक्रमीय डेटा के भीतर मतभेद और समानता का पता लगाता हैसेट. हर स्पेक्ट्रम एक बहुआयामी प्रत्येक रमन बदलाव के लिए एकत्र मोर्चों पर आधारित अंतरिक्ष में एक बिंदु के रूप में साजिश रची है. प्रत्येक सिद्धांत घटक (पीसी) कुल मूल डेटा में निहित जानकारी की एक निश्चित मात्रा का वर्णन करता है. पहला पीसी कि भिन्नता के उच्चतम स्रोत होता है. प्रत्येक निम्नलिखित पीसी क्रम में शामिल हैं, पिछले एक की तुलना में कम जानकारी है. हर चर और प्रत्येक पीसी पर एक लोडिंग स्कोर है. पीसी (= स्कोर) की साजिश रचने के द्वारा, महत्वपूर्ण नमूना परस्पर को उजागर किया जा सकता है. लोडिंग पीसीए के लिए प्रत्येक विश्लेषण चर के योगदान का वर्णन. हर नमूना समूह के लिए पंक्ति पर्वतमाला बनाने के द्वारा माप के प्रत्येक समूह के लेबल. पीसीए के लिए निम्नलिखित मूल सेटिंग्स का उपयोग करें: पार सत्यापन, NIPALS एल्गोरिथ्म, कोई रोटेशन और विश्लेषण शुरू. ये सेटिंग्स स्पेक्ट्रा निर्भर हैं. पीसीए प्रदर्शन करना. 6. प्रतिनिधि परिणाम रमन सपापक्षपाती कोशिकाओं से उत्पन्न ectra अक्सर एक कम संकेत से शोर अनुपात और एक कम कुल संकेत तीव्रता छवि (1) तथ्य यह है कि लेजर ध्यान केंद्रित करने के लिए गिलास नीचे, हस्तक्षेप के प्रभाव के निकट स्थापित किया जाना है के कारण 11 से पता चलता है कांच संकेत बल्कि उच्च है, वास्तविक नमूना संकेत के मास्किंग के कारण. नतीजतन, नमूना संकेत या कम से कम किया जा सकता है बाद में एक पृष्ठभूमि घटाव के दौरान भी सफाया कर दिया. इस प्रकार, हम निलंबन में हमारे रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए पसंद करते हैं, के रूप में वे अधिक विस्तृत वर्णक्रमीय जानकारी का पता लगाने की अनुमति है. हालांकि, पक्षपाती और निलंबन कोशिकाओं के स्पेक्ट्रा उनकी तीव्रता में केवल एक ही मुख्य भिन्न चोटियों दिखा रहे हैं. निलंबन के भीतर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए, कोई पूर्व उपचार की आवश्यकता है. मतलब रमन स्पेक्ट्रा और मानव fibroblasts, mesenchymal स्टेम सेल (MSCs), chondrocytes और keratinocytes के मानक विचलन के निलंबन में मापाचित्रा 2 में दर्शाया है. सभी रमन स्पेक्ट्रा इसी तरह हैं चोटियों प्रोटीन, nucleic एसिड और lipids जैसे ठेठ के biomolecules से प्रारंभिक (देखें तालिका 1) के साथ संरचित कर रहे हैं, इन सेल प्रकार के लिए, 12, 600 और अठारह सौ -1 सेमी सबसे अधिक प्रासंगिक वर्णक्रमीय जानकारी शामिल है के बीच वर्णक्रमीय क्षेत्र द्वारा. जो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं (2A छवि) के बीच स्पष्ट मतभेद detectable हैं. अनुकरणीय है, हम एक वर्णक्रमीय क्षेत्र (1280-1350 सेमी -1) स्पष्ट संरचनात्मक मतभेदों, जो कोलेजन और lipids की आणविक कंपन को आबंटित है प्रदर्शित करने पर प्रकाश डाला. इसके विपरीत में, रूपात्मक विश्लेषण पहचान और सबसे कोशिकाओं का गौरव (छवि 2B – मैं) के लिए उपयुक्त नहीं हैं. जबकि chondrocytes और त्वचा कोशिकाओं के बीच का अंतर दिखाई है (छवि 2d, एच बनाम बी, एफ और ई, मैं), fibroblasts और MSCs केवल उज्ज्वल क्षेत्र micrsoc का उपयोग कर अलग करने के लिए मुश्किल हैंopy (छवि 2B, एफ बनाम सी, जी) 13. ईसीएम प्रोटीन की विशेष रूप से देशी ऊतक, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण की आवश्यकता है कि एक लागत पर लाभ उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के द्वारा visualized किया जा क्रम में संबंधित संरचना पर ध्यान केंद्रित करने में सक्षम हो सकते हैं. एक विशिष्ट फिंगरप्रिंट स्पेक्ट्रम के लिए एक प्रोटीन के काम के लिए, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध प्रोटीन और immunohistologically दाग cryosections के रमन स्पेक्ट्रा उत्पन्न. यहाँ, हम देशी ऊतकों के भीतर लोचदार फाइबर lyophilized elastin और immunofluorescence से सना हुआ cryosections elastin के खिलाफ एक एंटीबॉडी रोजगार की तुलना की अंगुली की छाप स्पेक्ट्रा की पहचान की. हालांकि, के बाद से elastin के एक उच्च autofluorescence, जो रमन स्पेक्ट्रा में परिलक्षित होता है सुविधाएँ, डेटा विश्लेषण चुनौती दे रहा है (छवि 3A). Autofluorescence, डेटा सेट के एक उपयुक्त संसाधन के रूप में नमूना विशिष्ट गुण के कारण व्यवस्थित विफलता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे डेटा में एकalyses, हम सामान्य इस्तेमाल करने के लिए काफी अधिक शुद्ध elastin प्रोटीन का संकेत तीव्रता को समाप्त, और इस प्रकार, हम (छवि 3 बी) तुलनीय रमन स्पेक्ट्रा उत्पन्न करने में सक्षम थे. Elastin सबसे स्थिर शरीर में ECM प्रोटीन का है और इसलिए बहुत मुश्किल नीचा करने के लिए हमारी प्रयोगात्मक सेट में 14, हम स्वस्थ सुअर का महाधमनी वाल्व पत्रक में एक enzymatic पाचन प्रदर्शन elastin गिरावट प्रेरित किया. बहुभिन्नरूपी विश्लेषण पीसीए लागू है, हम enzymatically इलाज के नमूने और देशी नियंत्रण (छवि -3 सी) के रमन स्पेक्ट्रा के बीच महत्वपूर्ण अंतर की पहचान की. इन वर्णक्रमीय मतभेद के लोड हो रहा है स्पेक्ट्रम में 861, 1003 और १,६६४ -1 सेमी में मनाया गया. Elastin युक्त इलास्टेज के लिए बढ़ा जोखिम बार के कारण फाइबर में संरचनात्मक परिवर्तन की उम्मीद से दिखाया गया है हार्ट धुंधला छवि (4), (छवि -3 सी) जो भी अधिक विशिष्ट वियोज्य स्कोर समूहों में परिलक्षित किया गया. चित्रा 1 अलग और पक्षपाती fibroblasts के रमन स्पेक्ट्रा मतलब. चित्रा 2 (ए) रमन स्पेक्ट्रा और चार विभिन्न प्राथमिक अलग प्रकार की कोशिकाओं (fibroblasts, MSCs, chondrocytes और keratinocytes) का मानक विचलन मतलब. 1350 संरचनात्मक अंतर के साथ -1 सेमी – फ्रेम 1280 के वर्णक्रमीय क्षेत्र पर प्रकाश डाला गया. () अलग (बी) fibroblasts के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों, (सी) MSCs, (डी) chondrocytes और (ई) keratinocytes. स्केल बार 20 माइक्रोन के बराबर होती है. (FI) अनुयायी (एफ) fibroblasts के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों, (G) MSCs, (एच) chondrocytes और (मैं) keratinocytes. स्केल बार 200 माइक्रोन के बराबर होती है. चित्रा 3 (ए) lyophili की सामान्य बिना रमन स्पेक्ट्रा.जेड elastin (नीली रेखा), immunofluorescence (यदि) लेबल (नारंगी पंक्ति) cryosections और लोचदार फाइबर (लाल रेखा) देशी महाधमनी वाल्व पत्रक के भीतर मापा. lyophilized elastin के उच्च संकेत तीव्रता के autofluorescence द्वारा कारण होता है. (बी) के सामान्य क्रम में प्रणालीगत विफलताओं को खत्म करने के बाद रमन स्पेक्ट्रा. (सी) स्कोर और गैर इलाज (लाल) नियंत्रण और enzymatically अपमानित (नीले और हरे रंग) देशी ऊतक के भीतर लोचदार फाइबर के बीच तुलना की लोडिंग. 4 आंकड़ा HART's से सना हुआ सुअर का महाधमनी वाल्व पत्रक. लोचदार फाइबर काले रंग में कल्पना की जाती है. (ए) और (ख) गैर इलाज नियंत्रण और (सी) और (डी) है कि 30 मिनट के लिए अपमानजनक एंजाइम elastin के इलास्टेज से अवगत कराया गया ऊतकों के नमूनों को दर्शाती दिखा. सेमी -1 में wavenumber </strong> 12 असाइनमेंट 717-719 CN Phospholipids 785-788 डीएनए / आरएनए कुर्सियां, OPO रीढ़ की हड्डी डीएनए / आरएनए 1003 – 1005 फेनिलएलनिन प्रोटीन 1220-1280 एमाइड तृतीय प्रोटीन 1445-1447 2 सीएच प्रोटीन लिपिड / 1655-1680 एमाइड आईसी = सी प्रोटीन लिपिड तालिका 1 रमन बैंड है कि सभी प्रकार की कोशिकाओं (fibroblasts, MSCs, chondrocytes और keratinocytes) के स्पेक्ट्रा के भीतर पता चला रहे हैं.

Discussion

रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी इन विट्रो सुसंस्कृत देशी ऊतकों के भीतर कोशिकाओं और ईसीएम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन कोशिकाओं में इस तरह के रूप में जैविक नमूने, विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त उपकरण है ^11,15,16 यहाँ, हम दिखा दिया है कि इस गैर संपर्क, लेबल मुक्त तकनीक की अनुमति देता है विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के भेदभाव और ईसीएम प्रोटीन गिरावट केवल इन जैविक नमूने की आंतरिक biomolecular संरचना पर आधारित का पता लगाने.

रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का प्रमुख लाभ गैर invasively इसके परिणामस्वरूप रमन स्पेक्ट्रा से एक नमूना की जैव रासायनिक अंगुलांक यों क्षमता है. अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी, जो इसी तरह की जानकारी पैदावार के विपरीत, रमन स्पेक्ट्रा से जलीय नमूने से एकत्र किया जा सकता है, पानी से रमन बिखराव के रूप में कमजोर है. इसके अलावा, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी केवल एक रंग का प्रकाश की backscattering का पता लगाने पर आधारित है, इसलिए, कोई नमूना प्रसंस्करण पूर्व माप की आवश्यकता है. इन विशेषताओं रा बनानाआदमी स्पेक्ट्रोस्कोपी vivo इमेजिंग अनुप्रयोगों में क्षमता के लिए एक आशाजनक विकल्प. इस संबंध में सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (कार) एक बहुत ही दिलचस्प तकनीक है क्योंकि यह तेजी से और सक्षम बनाता है वही कंपन हमारे प्रयोगों में उपयोग संकेतों के आधार पर डेटा की अधिक संवेदनशील अधिग्रहण ^15,16 multiphoton प्रेरित autofluorescence सहित अन्य वैकल्पिक तरीकों. और दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी इमेजिंग पहले किया गया है गैर या कम से कम invasively जैविक नमूने की निगरानी के लिए उपयुक्त होना सिद्ध ¹⁷ हालांकि, इन इमेजिंग रूपात्मकता बहुत उच्च लागत के साथ जुड़े रहे हैं. और autofluorescence पैदा अणुओं के लिए सीमित कर रहे हैं. इसके अलावा, रमन स्पेक्ट्रोमीटर पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ गठबंधन करने के लिए आसान है. इन विशेषताओं रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी शारीरिक वातावरण में जैविक नमूनों के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाते हैं.

हमारे रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी की वर्तमान सीमाओं में से एक सेट हैअपेक्षाकृत छोटे लेजर (250 एनएम पूर्ण चौड़ाई आधा (FWHM) अधिकतम पार्श्व और 700 एनएम FWHM अक्षीय) ध्यान केंद्रित है कि एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य (एनए = 1.2) के द्वारा बनाया जाता है. हालांकि एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उत्सर्जित रमन प्रकाश एक उच्च संकेत से शोर अनुपात में उपज का एक अच्छा राशि को कवर करने की अनुमति देता है, उच्च एनए ही नमूना है कि आम तौर पर अधिक एक सेल की तुलना में छोटे के भीतर एक छोटे से संग्रह ध्यान केंद्रित पैदा करता है. आदेश में विभिन्न कोशिकाओं के रमन स्पेक्ट्रा तुलना करने के लिए, एक प्रतिनिधि स्पेक्ट्रम का संग्रह आवश्यक है, जो एक छोटे से फोकस क्षेत्र के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है. इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम करने के लिए एक कक्ष के भीतर विभिन्न बिंदुओं (= रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी मानचित्रण), एक औसत और एक प्रतिनिधि स्पेक्ट्रम उपज वर्णक्रमीय में जिसके परिणामस्वरूप के संकेत संग्रह को स्वचालित प्रक्रिया पर काम कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, इस तकनीक का एक कोशिका के भीतर प्रोटीन वितरण के उदाहरण के लिए विशिष्ट रमन बैंड के वितरण की एक सिंहावलोकन प्रदान करेगा.

बॉयogical नमूने अत्यधिक जटिल कर रहे हैं और biomolecules कि एकत्र रमन स्पेक्ट्रा के लिए योगदान की एक विषम मिश्रण से मिलकर बनता है. इसलिए, वर्णक्रमीय पैटर्न बेहद जटिल है और एक रमन स्पेक्ट्रम के भीतर एक अणु का एक प्रकार की निगरानी के लिए अलग अणु संकेतों के अतिव्यापी के साथ पूरा करने के लिए मुश्किल है. इसके अतिरिक्त, नमूना के आंतरिक प्रतिदीप्ति कमजोर रमन संकेत का मूल्यवान जानकारी मुखौटा हो सकता है. दिलचस्प है, हमारे अध्ययन के पिछले कुछ में, हम रमन स्पेक्ट्रा में autofluorescence मुख्य कक्ष (MSCs और fibroblasts) के प्रकार के एक उचित विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर के बीच फर्क कारक के रूप में ¹³ की पहचान की. हम भी पहचान की है कि समग्र रमन संकेत तीव्रता में परिवर्तन के रूप में सेवा कर सकते हैं कोलेजन और महाधमनी वाल्व पत्रक के ईसीएम भीतर कोलेजन फाइबर के राज्य के लिए एक सूचक है. ⁹ हालांकि, जब इन ऊतकों में elastin के राज्य का विश्लेषण, हम इसी तरह के परिणाम का पता लगाने में सक्षम नहीं थे. परिणाम के रूप में वर्णितअनुभाग, हम केवल इलास्टेज इलाज के नमूने में विशिष्ट रमन बैंड के परिवर्तन का पता लगाने के जब देशी नियंत्रण की तुलना में सक्षम थे. हम enzymatically इलाज के नमूने के रूप में की उम्मीद में समग्र रमन संकेत की कमी नहीं देखा था. इन टिप्पणियों को एक अंक साजिश है कि एक स्पष्ट क्लस्टर गठन प्रकट नहीं के रूप में पिछले अध्ययन में देखा था इसके विपरीत ⁹ के परिणामस्वरूप, एंजाइमी उपचार के प्रभाव पीसीए परिणाम के भीतर detectable था. हम मानते हैं कि दो ईसीएम प्रोटीन, elastin और कोलैजेन के बीच इन विसंगतियों रूपात्मक मतभेद और अलग एंजाइमी गिरावट प्रक्रियाओं पर आधारित होते हैं: महाधमनी वाल्व पत्रक के भीतर, कोलेजन युक्त क्षेत्र (fibrosa) के एक सतत परत है कि कारण ढीला हो जाता है एंजाइमी उपचार, elastin के क्षेत्र (ventricularis) युक्त एक संजाल विन्यास के लिए जोखिम इलास्टेज छवि (4) के बाद खंडित दिखाई देता है जिससे है. एकल स्थान के माप इसलिए उपयुक्त नहीं थेelastin के नेटवर्क के भीतर इस तरह के छोटे ruptures का पता लगाने के लिए खाया. यहाँ, ऊतक के एक रमन मानचित्रण के लिए नेटवर्क के टूटने की पहचान में मदद मिलेगी.

जैविक नमूनों की रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी में एक और चुनौती माप समय कम है. एक समाधान के लिए लेजर शक्ति है, जो जब तक के रूप में जैविक नमूने तस्वीर क्षति से प्रभावित नहीं हैं के रूप में उपयुक्त है वृद्धि हुई है. हमारे वर्तमान प्रयोगों के सभी सबूत के सिद्धांत के बुनियादी अनुसंधान पर ध्यान केंद्रित अध्ययन कर रहे हैं, लेकिन, हमारे समग्र लक्ष्य के लिए पुनर्योजी चिकित्सा (उदाहरण के लिए ऊतक इंजीनियर उत्पादों की गुणवत्ता नियंत्रण), पूर्व प्रत्यारोपण भ्रष्टाचार निगरानी और सहित नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी लागू है कैंसर निदान.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
elastase	Worthington	LS006363
anti-elastin antibody	Sigma	HPA018111	1:75; citrate buffer
PBS	Lonza	17-512F
glass bottom dishes	Greiner BioOne	627860
The Unscrambler	CAMO
Opus	Bruker