Spettroscopia Raman è una tecnica adatta per il non-contatto, label-free analisi di cellule viventi, dell'ingegneria tissutale costrutti e tessuti nativi. Fonte specifici per le impronte digitali spettrali possono essere generati ed analizzati utilizzando l'analisi multivariata.
Non distruttivo, non-contatto e label-free tecnologie per monitorare colture cellulari e tissutali sono necessari nel campo della ricerca biomedica. 1-5 metodi di routine, tuttavia, attualmente disponibili richiedono fasi di elaborazione e alterare l'integrità del campione. Spettroscopia Raman è un metodo rapido che permette la misurazione di campioni biologici senza necessità di ulteriori fasi di lavorazione. . Questo laser-tecnologia basata rileva la diffusione anelastica di luce monocromatica 6 In ogni vibrazione chimica è assegnato ad una specifica banda Raman (numero d'onda in cm -1), ciascun campione biologico presenta un tipico andamento spettrale a causa della loro intrinseca composizione biochimica 7. – 9 Entro spettri Raman, l'intensità dei picchi in correlazione con l'ammontare delle obbligazioni presenti molecolari. 1 Analogie e differenze dei set di dati spettrali possono essere rilevati utilizzando un'analisi multivariata (es. analisi delle componenti principali (PCA)) 10. </sup>
Qui, noi dobbiamo fare spettroscopia Raman di cellule e tessuti viventi native. Le cellule sono seminate o sulle antenne fondo di vetro o mantenuto in sospensione in condizioni normali colture cellulari (37 ° C, 5% CO 2) prima della misurazione. Tessuti nativi sono sezionati e memorizzati in salina tamponata con fosfato (PBS) a 4 ° C misurazioni precedenti. A seconda del nostro set up sperimentale, abbiamo quindi sia focalizzata sul nucleo della cellula o della matrice extracellulare (ECM) proteine, quali il collagene e l'elastina. Per tutti gli studi, un minimo di 30 celle o 30 punti casuali di interesse all'interno del ECM vengono misurate. Fasi di elaborazione dei dati inclusi sottrazione del fondo e la normalizzazione.
Spettroscopia Raman è un attrezzo adatto per analizzare campioni biologici, come in vitro-colture di cellule e proteine ECM così come le cellule all'interno dei tessuti nativi. 11,15,16 Qui, abbiamo dimostrato che questo non-contatto, privo di etichetta tecnica permette discriminazione di differenti tipi di cellule e la rilevazione della degradazione proteica ECM esclusivamente in base alla composizione biomolecolare intrinseca di questi campioni biologici.
Il principale vantaggio della spettroscopia Raman è la capacità di non-invasivo quantificare l'impronta digitale biochimica di un campione dalla sua spettri Raman risultante. In contrasto con spettroscopia infrarossa, che produce informazioni simili, spettri Raman può essere raccolto da campioni acquosi, come la dispersione Raman dall'acqua è debole. Inoltre, spettroscopia Raman si basa unicamente sulla rilevazione di backscattering di luce monocromatica, pertanto, non è richiesta l'elaborazione del campione precedente misura. Questi attributi rendono Raspettroscopia uomo una promettente alternativa per il potenziale de applicazioni di imaging in vivo. A questo proposito, coerente anti-Stokes spettroscopia Raman (CARS) è una tecnica molto interessante in quanto permette l'acquisizione veloce e più sensibile dei dati in base ai segnali vibrazionali stessi utilizzati nei nostri esperimenti. 15,16 Altri metodi alternativi tra cui multiphoton indotta autofluorescenza e seconda immagini generazione armonica sono stati precedentemente dimostrato di essere adatto per il monitoraggio di campioni biologici non invasivo o minima. 17 Tuttavia, queste modalità di imaging sono associati con costi molto elevati e sono limitati a autofluorescenza generatrici molecole. Inoltre, spettrometro Raman è facile da abbinare con tradizionali microscopi ottici. Queste caratteristiche rendono la spettroscopia Raman uno strumento prezioso per studiare campioni biologici in ambienti fisiologici.
Uno dei limiti attuali della nostra spettroscopia Raman è istituitoil fuoco del laser relativamente piccola (250 nm intero massimo metà larghezza (FWHM) laterale e 700 nm FWHM assiale) che viene creato da un obiettivo ad alta apertura numerica (NA = 1,2). Sebbene un elevato apertura numerica permette di coprire una buona quantità di luce emessa Raman cedere in un alto rapporto segnale-a-rumore, l'elevata NA produce solo un piccolo fuoco raccolta all'interno del campione che è in genere molto più piccola di una cella. Per confrontare gli spettri Raman di cellule differenti, la raccolta di uno spettro rappresentativo è essenziale, che è difficile da ottenere con una piccola area di messa. Per risolvere questo problema, stiamo lavorando su un processo per automatizzare la raccolta del segnale in diversi punti all'interno della cellula (= mappatura spettroscopica Raman), con un conseguente spettrale media e cedere ad uno spettro rappresentativo. Inoltre, questa tecnica fornisce una panoramica della distribuzione delle specifiche bande Raman, ad esempio della distribuzione proteina all'interno di una cellula.
BiolI campioni ogical sono estremamente complessi e costituiti da una miscela eterogenea di biomolecole che contribuiscono alla raccolta spettri Raman. Pertanto, il modello spettrale è molto complessa e il controllo di un singolo tipo di una molecola all'interno di uno spettro Raman è difficile da realizzare con la sovrapposizione di segnali molecolari diversi. Inoltre, fluorescenza intrinseca del campione può mascherare preziose informazioni di deboli segnali Raman. È interessante notare che in alcuni dei nostri studi precedenti, abbiamo individuato in autofluorescenza gli spettri Raman come il principale fattore di differenziazione tra i tipi di cellule (fibroblasti e MSC) utilizzando uno strumento adeguato di analisi 13. Abbiamo anche individuato che i cambiamenti di intensità complessiva del segnale Raman può servire come un indicatore per lo stato di collagene e le fibre di collagene all'interno della ECM di lembi valvolari aortici. 9 Tuttavia, quando si analizza lo stato di elastina in questi tessuti, non siamo stati in grado di rilevare risultati simili. Come indicato nel risultatosezione s, si è invece in grado di rilevare alterazioni specifiche bande Raman elastasi nei campioni trattati rispetto ai controlli nativi. Non abbiamo visto una diminuzione complessiva del segnale Raman nei enzimaticamente trattati con campioni come previsto. Queste osservazioni portato in una trama punteggio che non ha rivelato una formazione di cluster chiaro come si vede nello studio precedente. 9 Al contrario, l'influenza del trattamento enzimatico è rilevabile nei risultati PCA. Partiamo dal presupposto che queste differenze tra i due proteine ECM, elastina e il collagene, si basano sulle differenze morfologiche e diversi processi di degradazione enzimatica: all'interno del lembo della valvola aortica, il collagene ricco di zone (fibrosa) è uno strato continuo che viene allentato a causa della trattamento enzimatico, per cui la zona contenente elastina (ventricularis) ha una configurazione di rete che appare frammentato dopo l'esposizione a elastasi (Fig. 4). Le misurazioni in loco singoli stati, pertanto, non approprimangiava per rilevare tali rotture piccoli all'interno della rete elastina. Qui, una mappatura Raman del tessuto aiuterebbe a identificare i guasti nelle reti.
Un'ulteriore sfida in spettroscopia Raman di campioni biologici è quello di ridurre i tempi di misura. Una soluzione è quella di aumentare la potenza del laser, che è adatto finché i campioni biologici non sono interessati da foto-danni. Tutti i nostri esperimenti in corso sono la prova di principio studi incentrati sulla ricerca di base, tuttavia, il nostro obiettivo generale è quello di implementare la spettroscopia Raman per applicazioni cliniche compresa la medicina rigenerativa (ad esempio: controllo della qualità dei prodotti dell'ingegneria tissutale), pre-trapianto e trapianto di monitoraggio la diagnostica del cancro.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Steffen Koch per il suo supporto tecnico e Shannon Lee Layland (sia IGB Fraunhofer di Stoccarda) per i suoi utili suggerimenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Attrarre programma del Fraunhofer-Gesellschaft e la BMBF (sia per KS-L.).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
elastase | Worthington | LS006363 | |
anti-elastin antibody | Sigma | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
PBS | Lonza | 17-512F | |
glass bottom dishes | Greiner BioOne | 627860 | |
The Unscrambler | CAMO | ||
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