Raman-spektroskopi är en lämplig teknik för beröringsfri, etikett-fri analys av levande celler, vävnadstekniska konstruktioner och de infödda vävnader. Källspecifika kan spektrala fingeravtryck genereras och analyseras med multivariat analys.
Icke-förstörande, icke-kontakt och märkning fritt teknik för att övervaka cell-och vävnadskulturer behövs inom biomedicinsk forskning. 1-5 men för närvarande finns tillgängliga rutinmässiga metoder kräver bearbetning steg och ändra prov integritet. Raman-spektroskopi är en snabb metod som möjliggör mätning av biologiska prover utan behov av ytterligare bearbetningssteg. . Denna laser-baserad teknik upptäcker oelastiska spridning av monokromatiskt ljus 6 Eftersom alla kemiska vibration tilldelas ett specifikt Raman band (vågtal i cm -1), har varje biologiskt prov ett typiskt spektral mönster på grund av deras inneboende biokemiska sammansättning 7. – 9 Inom Raman spektra, de toppintensiteterna korrelerar med mängden av de nuvarande molekylära bindningar. 1 Likheter och skillnader i de spektrala datamängder kan upptäckas genom att använda en multivariat analys (t.ex. principalkomponentanalys (PCA)). 10 </sup>
Här utför vi Raman-spektroskopi av levande celler och infödda vävnader. Celler är antingen sås på rätter glas botten eller hålls i suspension under normala förhållanden cellodling (37 ° C, 5% CO 2) före mätning. Naturliga vävnader dissekeras och lagras i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C före mätning. Beroende på vårt experimentella uppsättning, då vi antingen fokuserat på cellkärnan eller extracellulär matris (ECM)-proteiner, såsom elastin och kollagen. För alla studier är minst 30 celler eller 30 slumpmässiga punkter av intresse inom ECM mätas. Stegen för databearbetningen ingår bakgrundssubtraktion och normalisering.
Raman-spektroskopi är ett lämpligt verktyg för att analysera biologiska prover, såsom in vitro-odlade celler och ECM-proteiner såväl som celler i nativa vävnader. 11,15,16 Här visade vi att denna icke-kontakt, kan etiketten utan teknik för diskriminering av olika celltyper och detektion av ECM proteinnedbrytning enbart baserat på den egentliga biomolekylära sammansättningen av dessa biologiska prover.
Den stora fördelen med Raman-spektroskopi är förmågan att icke-invasivt mäta den biokemiska fingeravtrycket av ett prov genom dess resulterande Raman-spektra. I motsats till infraröd spektroskopi, vilket ger motsvarande information, kan Raman-spektra tas från vattenhaltiga prover, som Raman-spridning från vatten är svag. Dessutom är Raman-spektroskopi enbart på detektion av bakåtspridning av monokromatiskt ljus, därför är inget prov bearbetning som krävs före mätning. Dessa attribut gör Ramannen spektroskopi ett lovande alternativ till potentialen in vivo avbildningstillämpningar. I detta avseende är konsekvent anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) en mycket intressant teknik eftersom den möjliggör snabbare och känsligare förvärv av uppgifter som grundar sig på samma vibrational signalerna som används i våra experiment. 15,16 Andra alternativa metoder inklusive multiphoton-inducerad autofluorescens och andra harmoniska generationens avbildning har tidigare visat sig vara lämplig för övervakning av biologiska prover icke-eller minimal invasivt 17. Men dessa avbildningsmetoder förknippas med mycket höga kostnader och är begränsade till autofluorescens-genererande molekyler. Dessutom är Raman-spektrometer lätt att kombinera med konventionella optiska mikroskop. Dessa egenskaper gör Raman-spektroskopi ett värdefullt verktyg för att studera biologiska prover i fysiologiska miljöer.
En av de nuvarande begränsningarna hos vår Ramanspektroskopi inrättat ärden relativt lilla laserfokus (250 nm full bredd halva maximum (FWHM) sidled och 700 nm FWHM axiell) som skapas av en hög numerisk apertur eftersträvade (NA = 1,2). Även en hög numerisk apertur kan täcka en god mängd av det emitterade ljuset Raman vilket gav i en hög signal-till-brusförhållande, alstrar den höga NA endast en liten samling fokus inom provet som är typiskt mycket mindre än en cell. För att jämföra Raman-spektra för olika celler, är den samling av ett representativt spektrum nödvändig, vilket är svårt att erhålla med en liten fokusområde. För att lösa detta, vi arbetar på en process för att automatisera signalen samlingen vid olika punkter i cellen (= Raman spektroskopi kartläggning), vilket resulterar i en spektral genomsnitt och ger en representativ spektrum. Dessutom kommer denna teknik ge en översikt över fördelningen av specifika Raman-band, exempelvis av proteinet fördelning inom en cell.
Biological prover är mycket komplexa och består av en heterogen blandning av biomolekyler som bidrar till den insamlade Raman-spektra. Därför är det spektrala mönstret mycket komplexa och övervakning av en enda typ av en molekyl inom ett Raman-spektrum är svårt att åstadkomma med överlappningen av olika molekyl-signaler. Dessutom kan inneboende fluorescens provet maskera värdefull information om svagare Raman signaler. Intressant, i några av våra tidigare studier identifierade vi autofluorescens i Raman spektra som den viktigaste särskiljande faktor mellan celltyper (MSC och fibroblaster) med hjälp av en lämplig analysverktyg. 13 Vi identifierade också att förändringar i den totala Raman signalintensiteten kan fungera som en indikator för staten av kollagen och fibrer kollagen inom ECM av aortaklaffen broschyrer. 9 Men när man analyserar tillståndet av elastin i dessa vävnader, har vi inte kunnat upptäcka liknande resultat. Såsom nämnts i det resultatetsektionen, var vi bara kan upptäcka förändringar i specifika Raman-band i elastas-behandlade prover jämfört med infödda kontrollerna. Vi såg inte en minskning av den totala Raman signalen i den enzymatiskt behandlade prover som förväntat. Dessa observationer resulterade i en poäng tomt som inte visar en tydlig klusterbildning sett i den tidigare studien. 9 Däremot var inflytandet av den enzymatiska behandlingen upptäckas inom PCA resultaten. Vi antar att dessa skillnader mellan de två ECM-proteiner, elastin och kollagen, är baserade på morfologiska skillnader och olika enzymatiska nedbrytningsprocesser: inom aortaklaffen broschyren är kollagen-rika zonen (fibrosa) ett kontinuerligt skikt som blir lossas på grund av enzymatisk behandling, varigenom elastin innehåller zonen (ventricularis) har en nätkonfiguration som visas fragmenteras efter exponering för elastas (fig. 4). Enstaka plats mätningar var därför inte lämpåt att upptäcka sådana små bristningar i elastin nätet. Här skulle en Raman kartläggning av vävnaden hjälpa till att identifiera driftstopp.
En annan utmaning i Raman-spektroskopi av biologiska prover är att minska mätning gånger. En lösning är att öka den lasereffekt, som är lämplig så länge som de biologiska proverna inte påverkas av foto-skada. Alla våra nuvarande experiment proof-of-principle studier som fokuserar på grundforskning, men det är vårt övergripande mål att genomföra Raman-spektroskopi för kliniska tillämpningar inklusive regenerativ medicin (t.ex. kvalitetskontroll av vävnadstekniska produkter), pre-transplantation transplantat övervakning och cancerdiagnostik.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Steffen Koch för hans teknisk support och Shannon Lee Layland (både Fraunhofer IGB Stuttgart) för hans hjälpsamma förslag på manuskriptet. Detta arbete ekonomiskt stöd från Attract program Fraunhofer-Gesellschaft och BMBF (både KS-L.).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
elastase | Worthington | LS006363 | |
anti-elastin antibody | Sigma | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
PBS | Lonza | 17-512F | |
glass bottom dishes | Greiner BioOne | 627860 | |
The Unscrambler | CAMO | ||
Opus | Bruker |