Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции
Summary
Полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия является мощным подход наблюдать структуры, близкие к поверхности клетки, при высокой контрастности и временным разрешением. Мы показываем, как TIRF могут быть использованы для изучения динамики белков в коре клеточной стенки закрытой бактериальных и грибковых клеток.
Abstract
TIRF микроскопия превратилась в мощную технологию визуализации для изучения пространственно-временной динамики флуоресцентных молекул в пробирке и в живых клетках 1. Оптическое явление полного внутреннего отражения, происходит при прохождении света из среды с высоким показателем преломления в среду с низким показателем преломления под углом больше, чем характерный критический угол (т.е. ближе к параллельно с границей). Несмотря на весь свет отражается обратно в таких условиях, затухающих волн создается, что распространяется вдоль и поперек границы, которая экспоненциально убывает с расстоянием, и только проникает в пример районы, 100-200 нм вблизи границы 2. В дополнение к превосходной осевой резолюции, снижение возбуждения в фокусе флуорофоров создает очень высокое отношение сигнал шум и свести к минимуму пагубные последствия фотообесцвечивания 2,3. Будучи техника широкопольных, TIRF позволяет быстрее изображение переменного токаquisition, чем большинство сканирования на основе конфокальной установки.
На первый взгляд, низкая глубина проникновения TIRF кажется несовместимым с изображениями бактериальных и грибковых клеток, которые часто окружены толстыми стенами клетки. Напротив, мы обнаружили, что клеточные стенки дрожжей и бактериальных клеток на самом деле повысить удобство работы с TIRF и расширить диапазон наблюдаемых структур 4-8. Многие клеточные процессы, поэтому могут быть непосредственно доступны TIRF в небольших, одноклеточные микроорганизмы, которые часто предлагают мощных методов генной манипуляции. Это позволяет выполнять в естественных условиях эксперименты биохимии, где кинетика белковых взаимодействий и деятельности могут быть непосредственно оценивается в живых клетках.
Мы описываем здесь отдельные шаги, необходимые для получения изображений высокого качества для TIRF Saccharomyces CEREVISIAE или Сенная палочка клеток. Отметим, различные проблемы, которые могут AffeКТ TIRF визуализации флуоресцентных зондов в клетках и иллюстрации процедуры с несколькими примерами применения. Наконец, мы показали, как TIRF изображений может быть улучшено с использованием установленных методов восстановления изображений.
Protocol
Discussion
TIRF микроскопии является методом выбора для изображений периферических белков. Низкая глубина проникновения неоднородных полей минимизирует вне фокуса света, что приводит к очень хороший сигнал-шум и позволяет сбор данных с высокой частотой кадров или изображений очень слабо выражен…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Обществом Макса Планка.
Materials
| Name of the tool/reagent | Type | Company | Catalogue number |
| Orbital Shaker | Tool | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscope | Till | Customized setup | |
| Glass container | Tool | Vitlab | 340-232880353 |
| Ceramic staining rack | Tool | Thomas Sci. | 8542E40 |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | L7647 |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Microscope | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Microscope Slides | Microscope | Menzel Gläser | AA00000102E |
| Immersion Oil | Microscope | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarose | Reagent | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagent | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
