ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה"כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות
Summary
השתקפות פנימית מוחלטת פלואורסצנטי (TIRF) מיקרוסקופיה היא גישה חזקה כדי לבחון מבנים סמוך לפני השטח של התא על ניגודיות גבוהה ורזולוציה הזמני. אנו מדגימים כיצד TIRF יכול להיות מועסק על מנת ללמוד על הדינמיקה חלבונים בקליפת המוח של קיר סגורים תאים תאים חיידקיים פטרייתי.
Abstract
מיקרוסקופיה TIRF התפתחה טכנולוגיית ההדמיה עוצמה ללמוד במרחב ובזמן בדינמיקה של מולקולות ניאון במבחנה בתאים חיים 1. תופעה אופטית של השתקפות פנימית מוחלטת מתרחשת כאשר האור עובר מתווך בעל מקדם שבירה גבוה לתוך בינוני עם מקדם שבירה נמוך בזווית גדולה יותר מזווית ביקורתית אופייני (כלומר קרוב יותר להיות במקביל הגבול). למרות כל האור משתקף בחזרה בתנאים כאלה, גל חולף נוצר כי תנועתו ברחבי ולאורך הגבול, אשר דועך אקספוננציאלית עם המרחק, ורק חודר אזורים מדגם כי הם 100-200 ננומטר ליד ממשק 2. בנוסף למתן החלטה צירית מעולה, עירור מופחת מתוך fluorophores מיקוד יוצר אות גבוהה מאוד יחסי רעש ממזער ההשפעות המזיקות של photobleaching 2,3. להיות טכניקה widefield, TIRF גם מאפשר תמונה AC מהר יותרquisition יותר מרוב סריקה setups confocal מבוססות.
במבט ראשון, את עומק החדירה הנמוכה של TIRF נראה עולה בקנה אחד עם הדמיה של תאים חיידקיים פטרייתי, אשר מוקף בדרך כלל על ידי קירות התא עבה. נהפוך הוא, מצאנו כי דופן התא של שמרים תאים חיידקיים למעשה לשפר את השימושיות של TIRF ולהגדיל את טווח מבנים נצפים 4-8. תהליכים תאיים רבים ולכן ניתן לגשת ישירות קטנים, תאיים, אשר לעיתים קרובות מציעים עוצמה טכניקות מניפולציה גנטית של TIRF. זה מאפשר לנו לבצע ניסויים ביוכימיה vivo, שבו קינטיקה של אינטראקציות חלבון ופעילות ניתן להעריך באופן ישיר בתאים חיים.
נתאר כאן את הצעדים הנדרשים כדי להשיג בודדים TIRF תמונות באיכות גבוהה עבור cerevisiae Saccharomyces או תאים subtilis Bacillus. אנו להצביע על בעיות שונות שיכולות affeCT TIRF ויזואליזציה של בדיקות ניאון בתאים וכן להמחיש את הליך עם דוגמאות של יישומים שונים. לבסוף, אנו מראים כיצד תמונות TIRF ניתן לשפר עוד יותר באמצעות טכניקות מבוססות שיקום התמונה.
Protocol
Discussion
מיקרוסקופיה TIRF היא הטכניקה של בחירה לחלבונים תמונה הפריפריה. עומק החדירה הנמוך של תחום חלוף ממזער את האור של המוקד, אשר מוביל אות טובה מאוד יחס רעש ומאפשר רכישת נתונים עם מסגרת חליפין גבוה, או הדמיה של חלבונים ביטוי מאוד חלש. שילוב של ניגודיות גבוהה מסגרת חליפין גבוה ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מקס פלאנק החברה.
Materials
| Name of the tool/reagent | Type | Company | Catalogue number |
| Orbital Shaker | Tool | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscope | Till | Customized setup | |
| Glass container | Tool | Vitlab | 340-232880353 |
| Ceramic staining rack | Tool | Thomas Sci. | 8542E40 |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | L7647 |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Microscope | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Microscope Slides | Microscope | Menzel Gläser | AA00000102E |
| Immersion Oil | Microscope | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarose | Reagent | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagent | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
