Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten
Summary
Generierung von T-Lymphozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) gibt einen alternativen Ansatz der Verwendung von embryonalen Stammzellen für die T-Zell-basierten Immuntherapie. Verfahren zeigt, dass durch Verwendung von entweder<em> In-vitro-</em> Oder<em> In-vivo-</em> Ansaugsystem sind iPS der Lage, in sowohl herkömmliche als auch Antigen-spezifische T-Lymphozyten zu differenzieren.
Abstract
Der adoptive Transfer Zelle (ACT) von Antigen-spezifischen CD8 + cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) eine vielversprechende Therapie für eine Vielzahl von malignen Erkrankungen 1. CTLs können maligne Zellen durch Interaktion mit den Tumor-Antigene T-Zell-Rezeptoren (TCR) und Release Zellgifte sowie Zytokine, um maligne Zellen töten zu erkennen. Es ist bekannt, dass weniger differenzierte und zentral-Speicher-like (bezeichnet als hochreaktive) CTLs die optimale Population für ACT-basierten Immuntherapie sind, weil diese CTLs eine hohe proliferative Potential haben, sind weniger anfällig für Apoptose als differenzierter Zellen und haben eine höhere Fähigkeit, sich auf homöostatische Zytokine 2-7 reagieren. Aufgrund von Schwierigkeiten bei der Beschaffung eine hohe Anzahl solcher CTLs von Patienten gibt es eine dringende Notwendigkeit, einen neuen Ansatz für hoch reaktive Ag-spezifischen CTLs für eine erfolgreiche ACT-basierte Therapien zu generieren finden.
TCR Transduktion des Selbst-erneuerbaren StammzellenZellen für die Wiederherstellung des Immunsystems hat ein therapeutisches Potential für die Behandlung von Krankheiten 10.08. Allerdings ist die Herangehensweise an embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) von Patienten erhalten, nicht machbar. Obwohl die Verwendung von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) für therapeutische Zwecke ist allgemein in der Klinik 11-13 Anwendung gelangt ist, HSK Differenzierung und Proliferation einzusparen und HSK sind schwer zu zeigen de de vitro-Zellkultur 14-16. Aktuelle iPS-Technologie und die Entwicklung eines in vitro-System für den Gentransfer sind geeignet zur Erzeugung von iPS-Zellen Patienten ohne chirurgischen Eingriff. Darüber hinaus, wie WSR besitzen iPS unbestimmte proliferativen Kapazität in vitro, und es wurde gezeigt, in hämatopoetischen Zellen zu differenzieren. So haben iPS-Zellen grösseres Potenzial, um in ACT-basierten Immuntherapie im Vergleich zu üben wollen, oder Blutstammzellen verwendet werden.
Hier stellen wir Methoden für die Generierung von T-LymphozytenMonozyten aus iPS-Zellen in vitro und in vivo Programmierung von Antigen-spezifischen CTLs von IPS-Zellen zur Förderung der Krebs Immunüberwachung. Stimulation in vitro mit einem Notch-Liganden treibt T-Zell-Differenzierung von iPS-Zellen, TCR und Gentransduktion Ergebnisse in iPS-Zellen differenzieren in Antigen-spezifischen T-Zellen in vivo, die das Tumorwachstum verhindert. So zeigen wir, Antigen-spezifischen T-Zell-Differenzierung von iPS. Unsere Studien liefern eine potenziell effizienterer Ansatz zur Erzeugung von Antigen-spezifischen CTLs für ACT-basierten Therapien und erleichtern die Entwicklung von therapeutischen Strategien für Krankheiten.
Protocol
Discussion
Für ACT-basierten Therapien ist die in-vitro-Erzeugung einer großen Anzahl von hochreaktiven Ag-spezifischen T-Zellen in vivo Reinfusion eine optimale Ansatz. Obwohl unsere in vitro-Verfahren führt funktioneller T-Zellen aus iPS-Zellen, eine große Anzahl von iPS-Zellen-abgeleiteter Zellen in der ersten vier Wochen, insbesondere in der vierten Woche. Wir schließen daraus, dass die Überlebensrate Signale von Notch durch die DL1 sowie IL-7 und Flt3L nicht ausreichen, um das Überleben…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Shinya Yamanaka (Universität Kyoto) für die Bereitstellung von iPS-MEF-ng-20D-17-Zelllinie, Dr. Dario Vignali (St. Jude Children 's Research Hospital) zur Unterstützung der OT1-2A • pMig II Konstrukt, Dr. Juan Carlos Zuniga-Pflücker (Department of Immunology, University of Toronto) zum Abstützen des OP9 DL1-Zell-Linie, und Dr. Kent Vrana E (Institut für Pharmakologie, Penn State University College of Medicine) für die Unterstützung der Design dieser Studie. Dieses Projekt wird gefördert, unter Zuschüsse mit dem Grant Number K18CA151798 vom National Cancer Institute, der Barsumian Trust und der Melanoma Research Foundation (J. Song).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 |
| B6.129S7-Rag1tm1Mom/J | Jackson Laboratory | 002216 |
| Anti-CD3 (2C11) antibody | BD PharMingen | 553058 |
| Anti-CD28 (37.51) antibody | BD PharMingen | 553295 |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | BioLegend | 100202 |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | BioLegend | 100417 |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | BioLegend | 100714 |
| Anti-CD25 (3C7) antibody | BioLegend | 101912 |
| Anti-CD44 (1M7) antibody | BioLegend | 103012 |
| Anti-CD117 (2B8) antibody | BioLegend | 105812 |
| Anti-TCR-β (H57597) antibody | BioLegend | 109220 |
| Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody | BioLegend | 503810 |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | BioLegend | 505822 |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 |
| FBS | HyClone | SH3007.01 |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 |
| Polybrene | Sigma | 107689 |
| GeneJammer | Integrated Sciences | 204130 |
| RNA kit | Qiagen | 74104 |
| DNA kit | Qiagen | 69504 |
| CD8 Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-236 |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E |
| mFlt-3L | PeproTech | 250-31L |
| mIL-7 | PeproTech | 217-17 |
| Gelatin | Sigma | G9391 |
| FITC-anti-OVA antibody | Rockland Immunochemicals | 200-4233 |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 |
| 0.4 μm filter | MIllipore | |
| Moflo Cell Sorter | Dake Cytomation | |
| Calibur Flow Cytometer | BD | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific |
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