Génération des lymphocytes T à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) donne une approche alternative de l'utilisation de cellules souches embryonnaires à des cellules T à base d'immunothérapie. Procédé montre que, en utilisant soit In vitro Ou In vivo, les cellules iPS peuvent se différencier en lymphocytes T à la fois classiques et spécifiques de l'antigène.
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Article de méthode
Différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à l'égard des lymphocytes T
Dans cet article
Résumé
Résumé
Transfert de cellules adoptif (ACT) de lymphocytes T spécifiques de l'antigène CD8 + cytotoxiques (CTL) est un traitement prometteur pour une variété de tumeurs malignes 1. CTL peut reconnaître les cellules malignes en interagissant avec des antigènes tumoraux les récepteurs de cellules T (TCR) et cytotoxines libération ainsi que les cytokines pour tuer les cellules malignes. Il est connu que moins différenciés et du centre-mémoire (appelé comme hautement réactif) CTL sont la population optimale pour l'ACT à base d'immunothérapie, parce que ces CTL ont un potentiel de prolifération élevé, sont moins enclins à l'apoptose que les cellules plus différenciées et ont un une plus grande capacité à répondre à des cytokines homéostatiques 2-7. Toutefois, en raison de difficultés dans l'obtention d'un nombre élevé de CTL ces provenant de patients, il ya un besoin urgent de trouver une nouvelle approche pour générer hautement réactifs Ag-CTL spécifiques pour le succès des thérapies à base ACT-.
Transduction TCR de la tige d'auto-renouvelablecellules de reconstitution immunitaire a un potentiel thérapeutique pour le traitement de maladies 8-10. Toutefois, l'approche pour obtenir des cellules souches embryonnaires (CSE) provenant de patients n'est pas possible. Bien que l'utilisation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) à des fins thérapeutiques a été largement appliqué dans la clinique 11-13, CSH ont réduit la différenciation et la prolifération des capacités, et les CSH sont difficiles à développer dans la culture cellulaire in vitro 14-16. Dernières technologies de cellules iPS et le développement d'un système in vitro pour la livraison de gènes sont capables de générer des cellules iPS à partir de patients, sans aucune approche chirurgicale. En outre, comme les CES, les cellules iPS possèdent la capacité de prolifération indéfinie in vitro, et ont été montrés à se différencier en cellules hématopoïétiques. Ainsi, les cellules iPS ont un plus grand potentiel pour être utilisé dans ACT à base d'immunothérapie par rapport aux CES ou CSH.
Ici, nous présentons les méthodes pour la génération de lymphocytes Tcytes à partir de cellules iPS in vitro, in vivo et dans la programmation de l'antigène-CTL spécifiques à partir de cellules iPS pour la promotion de la surveillance du cancer immunitaire. Stimulation in vitro avec un ligand de Notch entraîne la différenciation des cellules T à partir de cellules iPS, et les résultats TCR transduction de gènes dans des cellules iPS se différencier en cellules spécifiques de l'antigène T in vivo, ce qui empêche la croissance tumorale. Ainsi, nous démontrons spécifique de l'antigène différenciation des cellules T à partir de cellules iPS. Nos études fournissent une approche potentiellement plus efficace pour générer des CTL spécifiques de l'antigène de l'ACT à base de thérapies et de faciliter l'élaboration de stratégies thérapeutiques pour les maladies.
Protocole
1. Culture cellulaire
- Préparation de cellules nourricières irradiées SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) pour la culture.
SNL76 / 7 cellules sont généralement maintenues dans les 10% de sérum de veau fœtal (FBS) Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) des médias.- Un récipient de culture ou le flacon est revêtue d'une solution de gélatine de 0,1% en 37 ° C; incubateur pendant 30 minutes avant la récupération SNL76 / 7 cellules de l'azote liquide.
- Lorsque SNL76 / 7 cellules atteignent la confluence, les cellules seront traitées à la trypsine off, centrifugé à 400 g pendant 5 min et remis en suspension dans un milieu frais.
- Remises e....
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Discussion
Pour ACT-thérapies basées sur la production in vitro d'un grand nombre de très réactifs Ag des cellules T spécifiques in vivo pour re-perfusion est une approche optimale. Bien que notre méthode in vitro donne lieu de fonctionnelles des cellules T à partir de cellules iPS, un grand nombre de cellules iPS dérivées des cellules meurent en quatre semaines, en particulier dans la quatrième semaine. Nous concluons que les signaux de survie de signalisation Notch médié par le DL1 a.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Nous remercions le Dr Shinya Yamanaka (Université de Kyoto) pour fournir iPS-MEF-Ng-20D-17 lignée cellulaire, le Dr Dario Vignali (recherche de l'Hôpital pour enfants St. Jude) pour supporter le OT1-2A • pMig II construction, le Dr Juan Carlos Zuniga-Pflücker (Département d'immunologie, Université de Toronto) pour supporter la lignée cellulaire OP9-DL1, et le Dr Kent Vrana E (Département de pharmacologie, Université de Penn State College of Medicine) pour aider à la conception de cette étude. Ce projet est financé, au titre des subventions avec le numéro de subvention K18CA151798 de l'Institut national du cancer, la Fiducie et de la recherche Barsumian mé....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| Souris C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S7-RAG1 tm1Mom / J | Jackson Laboratory | 002216 | |
| Anti-CD3 (2C11) antibody | BD PharMingen | 553058 | |
| Anti-CD28 (37,51) antibody | BD PharMingen | 553295 | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | BioLegend | 100202 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | BioLegend | 100417 | |
| Anti-CD8 (53 à 6,7) antibody | BioLegend | 100714 | |
| Anti-CD25 (3C7) antibody | BioLegend | 101912 | |
| Unti-CD44 (1M7) antibody | BioLegend | 103012 | |
| Anti-CD117 (2B8) antibody | BioLegend | 105812 | |
| Anti-TCR-β (H57597) antibody | BioLegend | 109220 | |
| Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody | BioLegend | 503810 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | BioLegend | 505822 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| FBS | HyClone | SH3007.01 | |
| Un brefeldine | Sigma | B7651 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| GeneJammer | Sciences intégrées | 204130 | |
| ARN kit | Qiagen | 74104 | |
| L'ADN kit | Qiagen | 69504 | |
| CD8 Kit d'isolation | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| Un tampon de lyse ACK | Lonza | 10-548E | |
| mFlt-3L | PeproTech | 250-31L | |
| mIL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| Gélatine | Sigma | G9391 | |
| FITC anti-OVA anticorps | Immunochemicals Rockland | 200-4233 | |
| Tampon de perméabilisation | Biolegend | 421002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Formaldéhyde | Sigma | F8775 | |
| 0,4 um filtre | Millipore | ||
| Trieur de cellules MoFlo | Cytomation Dake | ||
| Cytomètre en flux Calibur | BD | ||
| Cytomètre LSR débit II | BD | ||
| Souris de contention | Braintree scientifique |
Références
- Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Se....
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Réimpressions et autorisations
