Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T
Summary
Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de cualquiera<em> In vitro</em> O<em> En vivo</em> Sistema de inducción, las células iPS son capaces de diferenciarse en los linfocitos T, tanto convencionales como antígeno específico.
Abstract
La transferencia de células adoptivo (ACT) de antígenos específicos de células CD8 + linfocitos T citotóxicos (CTL) es un tratamiento prometedor para una variedad de tumores malignos 1. CTL puede reconocer las células malignas mediante la interacción con los antígenos tumorales receptores de células T (TCR), y citotoxinas liberación de citoquinas, así como para matar las células malignas. Se sabe que menos disociados y central-memoria como-(denominado altamente reactivo) CTL son la población óptima para ACT basado en inmunoterapia, porque estos CTL tienen un potencial proliferativo alta, son menos propensos a la apoptosis que las células más diferenciadas y tienen un mayor capacidad para responder a las citoquinas homeostáticos 2-7. Sin embargo, debido a las dificultades en la obtención de un elevado número de linfocitos T citotóxicos tales de los pacientes, hay una necesidad urgente de encontrar un nuevo enfoque para generar altamente reactivos Ag-CTLs específicos para el éxito a base de ACT-terapias.
TCR transducción del vástago auto-renovablecélulas para la reconstitución inmune tiene un potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades 8-10. Sin embargo, el enfoque para obtener células madre embrionarias (CME) de los pacientes no es factible. Aunque el uso de células madre hematopoyéticas (HSC) con fines terapéuticos ha sido ampliamente aplicado en la clínica de 11-13, las CMH se han reducido la capacidad de diferenciación y proliferación, y las CMH son difíciles de crecer en cultivo celular in vitro 14-16. La tecnología reciente de células iPS y el desarrollo de un sistema in vitro para la entrega de genes son capaces de generar células iPS de pacientes sin ningún tipo de abordaje quirúrgico. Además, como CME, las células iPS poseen la capacidad proliferativa indefinida in vitro, y se ha demostrado que se diferencian en células hematopoyéticas. De este modo, las células iPS tienen un mayor potencial para ser utilizado en el ACT basado en inmunoterapia en comparación con los CES o HSCs.
Aquí, se presentan métodos para la generación de linfocitos Tcitos de las células iPS in vitro y en vivo de la programación de antígenos específicos de linfocitos T citotóxicos de las células iPS para la promoción de la vigilancia del cáncer inmunológico. La estimulación in vitro con un ligando muesca impulsa la diferenciación de células T a partir de células iPS, y TCR resultados de transducción de genes en células iPS diferenciadores en antígenos específicos de células T in vivo, lo cual impide el crecimiento del tumor. De este modo, demostramos antígeno específico de la diferenciación de células T a partir de células iPS. Nuestros estudios proporcionan un enfoque potencialmente más eficientes para la generación de antígenos específicos de linfocitos T citotóxicos para las terapias basadas en ACT y facilitar el desarrollo de estrategias terapéuticas para las enfermedades.
Protocol
Discussion
Para ACT terapias basadas en la generación in vitro de un gran número de Ag altamente reactivos específicos de las células T in vivo para la re-perfusión es una solución óptima. Aunque nuestro método in vitro da lugar funcional de las células T a partir de células iPS, un gran número de células iPS derivadas de las células mueren en cuatro semanas, sobre todo en la cuarta semana. Se concluye que las señales de supervivencia de señalización Notch mediada por el DL1 así co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Shinya Yamanaka (Universidad de Kyoto) para proporcionar iPS-MEF-Ng-20D-17 línea celular, el Dr. Darío Vignali (Hospital St. Jude Childrens Research) para apoyar la OT1-2A • pMig II construcción, el Dr. Juan Carlos Zúñiga Pflucker (Departamento de Inmunología de la Universidad de Toronto) para el apoyo a la línea celular OP9-DL1, y el Dr. Kent Vrana E (Departamento de Farmacología de la Universidad de Penn State College of Medicine) para ayudar al diseño de este estudio. Este proyecto está financiado, en virtud de concesiones con el número de concesión K18CA151798 del Instituto Nacional del Cáncer, la Fundación Barsumian y el Melanoma Research Foundation (canción J.).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 |
| B6.129S7-Rag1tm1Mom/J | Jackson Laboratory | 002216 |
| Anti-CD3 (2C11) antibody | BD PharMingen | 553058 |
| Anti-CD28 (37.51) antibody | BD PharMingen | 553295 |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | BioLegend | 100202 |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | BioLegend | 100417 |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | BioLegend | 100714 |
| Anti-CD25 (3C7) antibody | BioLegend | 101912 |
| Anti-CD44 (1M7) antibody | BioLegend | 103012 |
| Anti-CD117 (2B8) antibody | BioLegend | 105812 |
| Anti-TCR-β (H57597) antibody | BioLegend | 109220 |
| Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody | BioLegend | 503810 |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | BioLegend | 505822 |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 |
| FBS | HyClone | SH3007.01 |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 |
| Polybrene | Sigma | 107689 |
| GeneJammer | Integrated Sciences | 204130 |
| RNA kit | Qiagen | 74104 |
| DNA kit | Qiagen | 69504 |
| CD8 Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-236 |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E |
| mFlt-3L | PeproTech | 250-31L |
| mIL-7 | PeproTech | 217-17 |
| Gelatin | Sigma | G9391 |
| FITC-anti-OVA antibody | Rockland Immunochemicals | 200-4233 |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 |
| 0.4 μm filter | MIllipore | |
| Moflo Cell Sorter | Dake Cytomation | |
| Calibur Flow Cytometer | BD | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific |
References
- Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
- Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
- Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
- Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
- Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
- Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
- Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
- Boztug, K., Med, N. .. E. n. g. l. .. J. .. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
- Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
- Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).
- Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
- Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
- Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
- Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).
