Oct4GiP Reporter Анализ по изучению генов, которые регулируют мышиных эмбриональных стволовых клеток обслуживания и Самообновление
Summary
Мы описываем флуоресценции анализа репортер быстро идентифицировать и охарактеризовать гены, которые регулируют содержание мышиных эмбриональных стволовых клеток и самообновлению.
Abstract
Плюрипотентности и самообновления две определяющие характеристики эмбриональных стволовых клеток (ES клетки). Понимание основных молекулярных механизмов значительно облегчит использование ЭС клеток для развития исследований биологии, болезнь моделирования лекарств и регенеративной медицины (обзор в 1,2).
Чтобы ускорить выявление и характеристика новых регуляторов ЭС клеток и поддержания самообновления, мы разработали флуоресценции репортера на основе анализа количественно измерить самообновлению статус в ЭС клетки мыши использованием Oct4GiP клеток 3. Oct4GiP клетки экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем Oct4 области промотора гена 4,5. Oct4 требуется для ES клетки самообновлению, и очень выраженная в ЭС клетки и быстро подавляется в процессе дифференцировки 6,7. В результате, GFP выражения и флуоресценции в клетках коррелирует репортер вернос единичной клетки ES 5 и флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) анализ может быть использован внимательно следить за самообновление состояния клетки на одном уровне ячейки 3,8.
В сочетании с РНК-интерференции, анализ Oct4GiP репортер может быть использована для быстрого выявления и изучения регуляторов ЭС клеток и поддержания самообновления 3,8. По сравнению с другими методами опробования самообновлению, удобнее, чувствительный, количественный, а также более низкую стоимость. Это может быть осуществлено в 96 – или 384-луночных планшетах для крупномасштабных исследований, таких как высокая пропускная способность экранов или генетического анализа эпистаза. Наконец, с помощью другой линии конкретных репортер линий ES клетки, анализ описанных здесь также может быть изменен, чтобы исследовать судьбу спецификации в процессе дифференцировки клетки ES.
Protocol
Discussion
Анализ Oct4GiP репортер мы описываем выше, можно количественно измерить степень самообновления против дифференциации. По сравнению с другими доступными методами, такими как морфологии на основе 12 и распространения / жизнеспособность на основе анализов, она предлагает высокую чувс?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Брэд Lackford для чтения и редактирования рукописей. Это исследование было поддержано Национальным институтом экологических наук, Национальный институт здоровья Внутренние Программы исследований Z01ES102745 (на GH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
| 100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs–triggers of gene silencing–into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
