Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie
Summary
We beschrijven een fluorescentie reporter test om snel te identificeren en karakteriseren genen die muis embryonale stamcellen onderhoud en zelfvernieuwing te reguleren.
Abstract
Pluripotentie en zelfvernieuwing zijn twee definities van de kenmerken van embryonale stamcellen (ES cellen). Het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanisme zal aanzienlijk vergemakkelijken het gebruik van ES-cellen voor de ontwikkelingsbiologie studies, ziekte modelleren, drug discovery, en regeneratieve geneeskunde (overzicht in 1,2).
Om de identificatie en karakterisering van nieuwe regulatoren van ES-cel onderhoud en zelfvernieuwing te bespoedigen, hebben we een fluorescentie-reporter-gebaseerde test om kwantitatief te meten van de zelfvernieuwing status in de muis ES-cellen met behulp van de Oct4GiP cellen 3. De Oct4GiP cellen brengen green fluorescent protein (GFP) onder controle van de Oct4 gen promotergebied 4,5. Oct4 is vereist voor ES-cel zelf-vernieuwing, en is hoog tot expressie in ES-cellen en snel down-gereguleerd tijdens de differentiatie van 6,7. Hierdoor GFP expressie en fluorescentie in de cellen reporter correleert trouwmet de ES-cel identiteit 5 en fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) analyse kan worden gebruikt om nauwlettend toezien op de zelfvernieuwing status van de cellen op de enkele cel niveau van 3,8.
In combinatie met RNAi, kan de Oct4GiP reporter test gebruikt worden om snel te identificeren en te bestuderen regulatoren van ES-cel onderhoud en zelfvernieuwing 3,8. In vergelijking met andere methoden voor het bepalen zelfvernieuwing is het handig, gevoelig kwantitatieve en lagere kosten. Het kan worden uitgevoerd in 96 – of 384-platen voor grootschalige studies zoals hoge-doorvoer schermen of genetische epistase analyse. Tenslotte door andere lijn-specifieke reporterconstructieproducten ES cellijnen kan de test hier beschreven ook worden gemodificeerd lot specificatie tijdens ES celdifferentiatie bestuderen.
Protocol
Discussion
De Oct4GiP reporter test beschrijven we hierboven kan kwantitatief meten van de mate van zelf-vernieuwing versus differentiatie. Vergeleken met andere beschikbare methoden, zoals morfologie gebaseerde 12 en proliferatie / levensvatbaarheid gebaseerde assays, biedt een hogere gevoeligheid en doorvoersnelheid, alsmede een directe meting van de embryonale stamcellen staat. Het is daarom zeer geschikt voor grootschalige schermen en genetische epistase analyse. Inderdaad, hebben wij en anderen met succes gebruikt …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Brad Lackford voor het lezen en bewerken van het manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Intramurale Research Program Z01ES102745 (naar GH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
| 100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs–triggers of gene silencing–into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
