Nous décrivons un test de fluorescence journaliste d'identifier rapidement et de caractériser les gènes qui régulent la souris de maintenance de cellules souches embryonnaires et l'auto-renouvellement.
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Article de méthode
Essai Reporter Oct4GiP d'étudier les gènes qui régulent la souris maintenance des cellules souches embryonnaires et l'auto-renouvellement
Dans cet article
Résumé
Résumé
Pluripotence et l'auto-renouvellement sont deux caractéristiques qui définissent les cellules souches embryonnaires (cellules ES). Comprendre le mécanisme moléculaire sous-jacent va grandement faciliter l'utilisation de cellules souches embryonnaires pour des études de biologie du développement, la modélisation des maladies, la découverte de médicaments et la médecine régénératrice (examiné en 1,2).
Pour accélérer l'identification et la caractérisation de nouveaux régulateurs de l'entretien des cellules ES et d'auto-renouvellement, nous avons développé une fluorescence journaliste basé test pour mesurer quantitativement l'état d'auto-renouvellement des cellules ES de souris en utilisant les cellules Oct4GiP 3. Les cellules Oct4GiP exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de la région promoteur du gène Oct4 4,5. Oct4 est nécessaire pour les cellules souches embryonnaires d'auto-renouvellement, et est fortement exprimée dans les cellules ES et rapidement régulé à la baisse lors de la différenciation 6,7. En conséquence, expression de la GFP et de la fluorescence dans les cellules reporter fidèlement corréléeavec l'identité des cellules ES 5, et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut être utilisé pour suivre de près l'état d'auto-renouvellement des cellules au niveau unicellulaire 3,8.
Couplé avec l'ARNi, le dosage journaliste Oct4GiP peut être utilisé pour rapidement identifier et d'étudier les régulateurs de l'entretien des cellules ES et l'auto-renouvellement 3,8. Comparé à d'autres méthodes de dosage de l'auto-renouvellement, il est plus commode, sensible, quantitative, et de moindre coût. Il peut être réalisé en 96 - ou 384 puits des plaques pour études à grande échelle tels que les écrans à haut débit ou d'analyse épistasie génétique. Enfin, en utilisant d'autres lignes spécifiques de lignée de cellules ES Reporter, le dosage que nous décrivons ici peuvent également être modifiées pour étudier les spécifications sort lors de la différenciation des cellules ES.
Protocole
1. Oct4GiP souris maintien des cellules ES
Cellules Oct4GiP ont été aimablement fournies par le Dr Austin Smith. Elles ont été calculées à partir des souris portant un transgène 129/Ola Oct4-GFPiresPac 4,5. Ils sont maintenus dans de la gélatine recouvertes de plaques de culture tissulaire dans le ESGRO qualité moyenne, plus complet clonale (Millipore), ou dans le milieu M15: DMEM (Invitrogen) supplémenté avec 15% de FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x non- acides aminés essentiels (Invitrogen), 1x Nucleasides EmbryoMax (Millipore), et 10 uM β-mercaptoéthanol.
- Manteau plaques avec 0,1% (Sigma) de la gélatine à la ....
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Discussion
Le dosage journaliste Oct4GiP nous décrivons ci-dessus peut mesurer quantitativement l'étendue de l'auto-renouvellement vs différenciation. Comparé à d'autres méthodes disponibles, tels que les 12 morphologie basée et la prolifération / viabilité à base de tests, il offre une sensibilité plus élevée et le débit, ainsi que d'une mesure plus directe de l'état de la cellule ES. Il est donc bien adapté pour les grands écrans et des analyses épistasie génétique. En effet, nous et d'autres o.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Nous tenons à remercier Brad Lackford pour la lecture et la relecture du manuscrit. Cette recherche a été financée par l'Institut national de l'environnement Sciences de la santé, les National Institutes of Health Research Programme intra-muros Z01ES102745 (à GH).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| Moyennes ESGRO année complète, ainsi que des clones | Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (glucose à haute 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0,25% de trypsine-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM (milieu sans sérum à réduire) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO MLIF (10 units/1ml 7) | Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (non-acides aminés essentiels) | Invitrogen | 11140 | |
| Nucléosides 100x pour les cellules souches embryonnaires | Millipore | 10620-1 | |
| Le 2-mercaptoéthanol | Sigma | M7522-100ml | |
| ES-qualifiée sérum de veau fœtal | Invitrogen | 10437 | |
| SiARN Nanog | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siARN | Dharmacon | D-046256-02 | |
| SiARN Sox2 | Dharmacon | M-058489-01 |
SiARN contrôle: duplex siRNA ciblant la luciférase de luciole (5'-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthétisée par Dharamcon.
Références
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: l....
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Réimpressions et autorisations
