マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を研究するためにOct4GiPレポーターアッセイ
Summary
我々はすぐに識別し、マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を特徴付けるための蛍光レポーターアッセイを説明します。
Abstract
多能性と自己複製は、胚性幹細胞（ES細胞）の2つの定義特性です。基本的な分子機構を理解することは非常に発生生物学研究、疾患モデル、創薬、再生医療（1,2日で）のES細胞の使用を容易にします。
ES細胞の維持と自己複製の新たな調節因子の同定と特徴付けを促進するために、我々は定量的にOct4GiPセル3を用いたマウスES細胞における自己複製の状態を測定する蛍光レポーターベースのアッセイを開発しました。 Oct4GiP細胞は4,5 Oct4の遺伝子のプロモーター領域の制御下にある緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する。 Oct4のは、ES細胞の自己複製に必要とされており、非常にES細胞で発現し、急速に分化6,7の間にダウンレギュレートされています。その結果、レポーター細胞におけるGFPの発現と蛍光が忠実に相関ES細胞のアイデンティティー5と、蛍光活性化セルソーティング（FACS）で分析が密接に単一細胞レベル3,8の細胞の自己複製状態を監視するために使用することができます。
RNAiのと相まって、Oct4GiPレポーターアッセイは、すぐにES細胞の維持と自己複製3,8のレギュレータを識別し、研究するために使用することができます。自己複製を分析するための他の方法に比べ、それ以上の、便利な高感度、定量的、かつ低コストである。それは、96に実施することができる – または、ハイスループットスクリーニングや遺伝子のエピスタシス解析などの大規模研究のための384ウェルプレート。最後に、他の系統特異的レポーターES細胞株を使用することによって、我々はここで説明するアッセイはまた、ES細胞の分化の間に運命の仕様を勉強するように変更することができます。
Protocol
Discussion
我々は上記の記述Oct4GiPレポーターアッセイは、定量的に自己再生対分化の程度を測定することができます。そのような形態をベース12と増殖/生存性アッセイなど他の利用可能な方法に比べ、より高い感度とスループットだけでなく、ES細胞の状態のより直接的な測定を提供しています。したがって、大規模な画面や遺伝的エピスタシス解析のために適している。実際、我々と他の成?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿を読んで、編集するためのブラッドLackfordに感謝します。この研究は国立環境健康科学研究所、保健学内研究プログラム国立研究所Z01ES102745（GHまで）によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
| 100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs–triggers of gene silencing–into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
