Biz hızla belirlemek ve fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme düzenleyen genlerin karakterize bir floresan reporter assay açıklar.
Pluripotency ve kendini yenileme embriyonik kök hücreleri iki belirleyici özellikleri (ES hücreleri) vardır. Altta yatan moleküler mekanizmayı anlamak oldukça gelişimsel biyoloji çalışmaları, hastalık modelleme, ilaç keşfi ve rejeneratif tıbbın (1,2 gözden) ES hücrelerin kullanımı kolaylaştıracaktır.
ES hücre bakım ve kendini yenileme romanı düzenleyicilerinin belirlenmesi ve tanımlanması hızlandırmak için, kantitatif Oct4GiP hücreleri kullanarak fare 3 ES hücrelerinin kendini yenileme durumunu ölçmek için floresans muhabiri bazlı analiz geliştirdi. Oct4GiP hücreleri 4,5 Oct4 geninin promotor bölgesinin kontrolü altında yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eder. Oct4 farklılaşma 6,7 sırasında ES hücre kendini yenileme için gereklidir ve son derece ES hücreleri ile ifade edilir ve hızlı bir şekilde aşağı düzenlenir. Bunun sonucu olarak, raportör hücrelerinde GFP tanımı ve floresans aslına ilişkilendirenES hücresi kimlik 5 ve floresans-aktive hücre ayırma ile (FACS) analizi yakından tek hücre seviyesinde 3,8 azından hücrelerinin kendini yenileme durumunu kontrol etmek için kullanılabilir.
RNAi ile birleştiğinde, Oct4GiP reporter assay hızlı ES hücre bakım ve kendini yenileme 3,8 regülatörleri belirlemek ve incelemek için kullanılabilir. Kendini yenileme içlin diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, daha fazla, uygun duyarlı, kantitatif, ve daha düşük maliyetli taşımaktadır. Bu tür yüksek verimli ekranlar veya genetik epistasi analiz gibi büyük ölçekli çalışmalar için veya plakaları 384-iyi – 96 yapılabilir. Son olarak, diğer soy özel muhabiri ES hücre hatları kullanılarak, biz burada açıklamak tahlil de ES hücre farklılaşması sırasında kaderi özellikleri incelemek için modifiye edilebilir.
Yukarıda tarif Oct4GiP reporter assay kantitatif kendini yenileme vs farklılaşma derecesini ölçebilirsiniz. Böyle morfolojisi tabanlı 12 ve proliferasyonu / deneyleri yaşayabilirliği bazlı gibi diğer yöntemler kullanılabilir, ile karşılaştırıldığında, daha yüksek verim ve hassasiyet yanı sıra ES hücresi durumunu daha doğrudan bir ölçüm sunmaktadır. Bu yüzden de, büyük ölçekli ekranlar ve genetik epistasi analizi için son derece uygundur. Nitekim, biz ve diğerleri başarıy…
The authors have nothing to disclose.
Biz okuma ve yazma düzenleme için Brad Lackford teşekkür ederim. Bu araştırma, Çevre Sağlığı Bilimleri, Sağlık İntramural Araştırma Programı Z01ES102745 National Institutes (GH) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.