नैनो फेम: प्रोटीन फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का स्थानीयकरण

Summary

हम एक इलेक्ट्रॉन micrographs में fluorescently टैग प्रोटीन स्थानीय बनाना विधि का वर्णन करता है. प्रतिदीप्ति 1 ultrathin वर्गों पर तस्वीर सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्थानीय है. इन छवियों को फिर से एक ही अनुभाग के इलेक्ट्रॉन micrographs के लिए गठबंधन कर रहे हैं.

Abstract

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for protein localization, but subcellular context is often absent in fluorescence images. Immuno-electron microscopy, on the other hand, can localize proteins, but the technique is limited by a lack of compatible antibodies, poor preservation of morphology and because most antigens are not exposed to the specimen surface. Correlative approaches can acquire the fluorescence image from a whole cell first, either from immuno-fluorescence or genetically tagged proteins. The sample is then fixed and embedded for electron microscopy, and the images are correlated ^1-3. However, the low-resolution fluorescence image and the lack of fiducial markers preclude the precise localization of proteins.

Alternatively, fluorescence imaging can be done after preserving the specimen in plastic. In this approach, the block is sectioned, and fluorescence images and electron micrographs of the same section are correlated ^4-7. However, the diffraction limit of light in the correlated image obscures the locations of individual molecules, and the fluorescence often extends beyond the boundary of the cell.

Nano-resolution fluorescence electron microscopy (nano-fEM) is designed to localize proteins at nano-scale by imaging the same sections using photo-activated localization microscopy (PALM) and electron microscopy. PALM overcomes the diffraction limit by imaging individual fluorescent proteins and subsequently mapping the centroid of each fluorescent spot ^8-10.

We outline the nano-fEM technique in five steps. First, the sample is fixed and embedded using conditions that preserve the fluorescence of tagged proteins. Second, the resin blocks are sectioned into ultrathin segments (70-80 nm) that are mounted on a cover glass. Third, fluorescence is imaged in these sections using the Zeiss PALM microscope. Fourth, electron dense structures are imaged in these same sections using a scanning electron microscope. Fifth, the fluorescence and electron micrographs are aligned using gold particles as fiducial markers. In summary, the subcellular localization of fluorescently tagged proteins can be determined at nanometer resolution in approximately one week.

Protocol

1. उच्च दबाव बर्फ़ीली अपने नमूना के लिए एक उपयुक्त माध्यम है (उदाहरण के लिए, संस्कृति सेल संस्कृतियों के लिए मध्यम, सी. एलिगेंस के लिए M9) की 1 मिलीग्राम में BSA के 0.2 ग्राम जोड़कर क्रायो protectant तैयार करो. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान ट्यूब सेते जब तक सभी BSA भंग है. ठंड के लिए पहले, तरल नाइट्रोजन के साथ स्वचालित उपकरण फ्रीज प्रतिस्थापन (Leica एएफएस) को भरने सेट एएफएस कार्यक्रम: -90 ° C 5-30 घंटा *, 5 के लिए सी / घंटा -60 ° ° C, -60 ° सी 2 घंटे (या "ठहराव" विकल्प का चयन करें यदि आप Leica एएफएस 2 का उपयोग कर रहे हैं) के लिए, 5 ° / सी -30 के लिए मानव संसाधन डिग्री सेल्सियस और -30 ° सी 72 घंटा के लिए. यदि एएफएस मशीन अधिक से अधिक पांच कदम होने के लिए सक्षम है, -30 डिग्री सेल्सियस कदम एक "ठहराव" 0 घंटा विकल्प सेट के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, और दो कदम आगे जोड़ा जाना चाहिए: 10 ° / सी -20 के लिए मानव संसाधन ° -20 डिग्री सेल्सियस पर सी और 24 घंटे यदि मशीन पांच कदम तक ही सीमित है, एक अलग स्मृति स्लॉट में किसी अन्य प्रोग्राम सेट के रूप में इस प्रकार है: 10 ° / सी -20 के लिए मानव संसाधन डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे-20 डिग्री सेल्सियस में आर * यहाँ समय समायोजित इतना है कि -60 डिग्री सेल्सियस कदम सुबह में शुरू कर सकते हैं. निर्जल एसीटोन (ईएमएस, RT10016 #) के 10 मिलीग्राम के साथ 0.1 छ आज़मियम tetroxide क्रिस्टल (ईएमएस, RT19134) के मिश्रण से 1% आज़मियम tetroxide स्टॉक समाधान तैयार. एक 50 मिलीलीटर के शंक्वाकार ट्यूब में fixatives तैयार करो. सबसे पहले, 1 milliQ पानी की मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और फिर इसे में पोटेशियम परमैंगनेट के 0.02 ग्राम (ईएमएस, RT20200) भंग. एसीटोन की 19 मिलीलीटर जोड़ें और यह अच्छी तरह से मिश्रण. अंत में, ट्यूब में 1% आज़मियम स्टॉक समाधान के 20 μl जोड़ें. एसीटोन एक मुक्त कट्टरपंथी मेहतर 11 है और इस तरह के प्लास्टिक के polymerization से बचाता है, लेकिन एक फ्रीज प्रतिस्थापन माध्यम के रूप में एसीटोन का उपयोग lipids के साथ अपनी बातचीत की वजह से morphology के संरक्षण के लिए आवश्यक है. एसीटोन प्लास्टिक घुसपैठ से पहले इथेनॉल के साथ प्रतिस्थापित किया जाएगा. अशेष भाजक 1 प्रत्येक cryovial मिलीलीटर और ट्यूबों तरल नाइट्रोजन में भंडारण के द्वारा जमे हुए fixatives रखना. 20% BSA या बैक्टीरिया के साथ एक नमूना वाहक भरें.दोनों 20% BSA और बैक्टीरिया क्रायो – protectants के रूप में सेवा करते हैं. नमूना वाहक के प्रकार के लिए पसंद नमूना पर निर्भर करता है. सी. के लिए एलिगेंस, एक 100 सुक्ष्ममापी अच्छी तरह से उपयोग करें. कैरियर में नमूना प्लेस और एक फ्रीजर उच्च दबाव का उपयोग कर यह फ्रीज. ठंड के बाद और तरल नाइट्रोजन के तहत, युक्त cryotube fixatives में नमूना हस्तांतरण. सुनिश्चित करें कि सभी समय पर तरल तहत नमूना रहता. 1.5 दोहराएँ) – 1.7) जब तक सभी नमूनों जमे हुए हैं. एएफएस इकाई में सभी cryotubes स्थानांतरण, और कार्यक्रम फिर से शुरू. 2. रुक प्रतिस्थापन जब तापमान -60 तक पहुँचता है डिग्री सेल्सियस, जगह एएफएस में 95% एसीटोन की 20 मिलीलीटर युक्त शीशियों. जब तापमान -50 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है, 2 घंटा की अवधि में 95% एसीटोन साथ fixatives छह बार की जगह. एक कक्ष में 95% एसीटोन में 0.1% uranyl एसीटेट की 20 मिलीलीटर (Polysciences, 21447-25 #) युक्त शीशी प्लेस औरपूर्व शांत यह -50 डिग्री सेल्सियस धोने कदम के अंत में, शीशी में से प्रत्येक के लिए ~ uranyl एसीटेट समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने. यदि आवश्यक हो तो कार्यक्रम अनपॉज़. जब तापमान -30 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है, 95% इथेनॉल के साथ 2 घंटे की अवधि पर uranyl एसीटेट छह बार की जगह. इस बीच में, 22.3 मिलीलीटर GMA, 10ml n-ब्यूटाइल Methacrylate, 1 मिलीलीटर milliQ पानी, और 0.2 ग्राम benzoyl पेरोक्साइड मिश्रण से 97% glycol methacrylate राल (GMA, SPI आपूर्ति / संरचना जांच, इंक, # 02,630 ए.ए.) (उत्प्रेरक). कांच की शीशियों में स्टोर (ईएमएस, 72,632 #) और यह 95% इथेनॉल के साथ मिश्रण से 30% GMA तैयार प्लास्टिक की ट्यूब में स्टोर न GMA मीडिया क्योंकि polymerization की गुणवत्ता polyethylene आधारित प्लास्टिक में लंबी अवधि के भंडारण के साथ degrades. पूर्व शांत GMA -30 डिग्री सेल्सियस समाधान पारंपरिक ऐसे Araldite और EPON के रूप में epoxy रेजिन प्रोटोकॉल में प्रयोग नहीं किया जा के बाद से वे निर्जल और अम्लीय है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन quenches कर सकते हैं. LR व्हाइट, ग के रूप में एक्रिलिक रेजिन,एक पानी की एक छोटी राशि सहन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की रक्षा कर सकते हैं, लेकिन इसकी अम्लीय पीएच 12 fluorophore बुझाने जाता है. GMA बर्दाश्त, वास्तव में आवश्यकता है, पानी की एक छोटी राशि है और क्षारीय (PH8) 12. GMA दुर्भाग्य से कुछ भंगुर है. इसके अलावा, GMA पारंपरिक epoxy करते रेजिन जैसे ऊतकों के साथ पार से लिंक नहीं है. गुणवत्ता सेक्शनिंग में GMA कारण विसंगति की इन विशेषताओं को विशेष रूप से जब sectioned 80 एनएम से पतली. हालांकि GMA की शेल्फ जीवन के बारे में एक वर्ष के है, GMA खरीद के 3 महीने के भीतर इस्तेमाल किया जा चाहिए और इसकी गुणवत्ता सुनिश्चित करने के. 3. घुसपैठ और polymerization 3.1-3.3 कदम के ही फ्रीज प्रतिस्थापन के लिए इस्तेमाल किया cryovials में किया जाता है. घुसपैठ और polymerization बाहर -30 डिग्री सेल्सियस एएफएस फ्लोरोसेंट प्रोटीन की रक्षा करने में किया जाता है. GMA स्टॉक समाधान 95% इथेनॉल के साथ मिश्रण से घुसपैठ मीडिया तैयार. नमूनों सेते3-5 घंटे के लिए 30% GMA में. 4-6 घंटे के लिए 70% GMA में नमूनों सेते हैं. 97% GMA में नमूनों रातोंरात सेते हैं. अगले दिन, ताजा 97% GMA. एक embedding मोल्ड (EBSciences, # टीसी) के लिए नमूने स्थानांतरण. / 3 8 "DISC पंच (टेड पेला इंक) द्वारा ACLAR फिल्म की एक डिस्क (ईएमएस, 50425-10 #) तैयार है और Beem कैप्सूल के नीचे में डिस्क जगह है. 6 से अधिक 97% GMA तीन बार -30 डिग्री सेल्सियस घंटा विनिमय विनिमय के बाद 3, 1.5 μl / 1 मिलीलीटर GMA के एक एकाग्रता में GMA सर्जक N, N-डाइमिथाइल-P-toluidine (सिग्मा Aldrich, D9912 #) और जोड़ने के प्रत्येक नमूना मोल्ड करने के लिए इस समाधान लागू. तुरंत एएफएस में embedding मोल्ड में नमूना स्थिति. ध्यान दें कि पेरोक्साइड उत्प्रेरक है और घुसपैठ के सभी चरणों के दौरान मौजूद है तो सरगर्मी आवश्यक नहीं है. पेरोक्साइड प्लास्टिक polymerize नहीं करता है जब तक यह रासायनिक सर्जक एन, एन, डाइमिथाइल-P-toluidine से अवगत कराया है. सर्जक नीति सक्रियymerization तुरंत और 1 घंटे के भीतर ऊतकों में भी राल polymerize जाएगा. फिर भी, ऊतक dropouts गहरी अधूरा polymerization के कारण ऊतकों में हो सकता है. इसके अलावा, GMA अच्छी तरह से ब्लॉक करने के लिए नमूना नहीं Crosslink करता है, तो cryoprotectant से बैक्टीरिया की मैट्रिक्स पर दोहन द्वारा नमूना अलग. यदि polymerization एक एएफएस बाहर किया जाता है, embedding ढालना ऑक्सीजन के लिए जोखिम ब्लॉक के लिए एक aclar डिस्क के साथ शामिल किया जाना चाहिए. GMA पूरी तरह से नहीं polymerize जब ऑक्सीजन के संपर्क करता है. प्लास्टिक रातोंरात का इलाज करने के लिए भले ही यह 1 घंटे के भीतर polymerizes की अनुमति दें. फ्रीजर में एक नाइट्रोजन गैस से भरे निर्वात (Ziploc) बैग (-20 डिग्री सेल्सियस) में आगे प्रसंस्करण तक नमूना स्टोर इतना है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन ऑक्सीजन के संपर्क में नहीं हैं. 4. सेक्शनिंग GMA एम्बेडेड नमूनों के प्रोटोकॉल एक EPON एम्बेडेड नमूनों के लिए इसी तरह की तरीके से किया जा सकता है. अतिरिक्त सावधानी रखना चाहिएगीले n सेक्शनिंग सतह क्योंकि GMA बहुत हाइड्रोफिलिक है और रिबन पानी स्नान में संचालित हो जाएगा अगर वे दोनों पक्षों पर गीला कर रहे हैं. (50-80 एनएम) एक गिलास coverslip पर वर्गों के रिबन लीजिए अगर एक TIRF खुर्दबीन स्थानीयकरण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. अन्यथा, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए बनाई गई एक ग्रिड का उपयोग करें. काटने गति at1.6 मिमी / या उच्च स्थापित किया जाना चाहिए. अन्यथा, एक रिबन नहीं हो सकता है. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर वर्गों अगर तुरंत imaged. पराबैंगनी प्रकाश से अनुभाग धारकों एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर द्वारा fluorophores को सुरक्षित रखें. 5. पाम इमेजिंग निर्माता की सिफारिशों के अनुसार पाम खुर्दबीन सेट. एक EMCCD कैमरे का तापमान -70 डिग्री सेल्सियस नीचे या निर्धारित किया जाना चाहिए. Imaged किया जा नमूना के समाधान में (लगभग 50 μl) – सोना (2x केंद्रित की microspheres nanospheres.com # 790122-010) कणों लागू. समाधान कवर पर 30 सेकंड के लिए बैठने के लिए अनुमति देंजबकि एक काले कवर के मामले के तहत होंठ. यह coverslip के किनारे को उड़ाने और यह एक kimwipe साथ अवशोषित द्वारा सोने समाधान निकालें. एक परिपत्र coverslip धारक में coverslip डालें. यदि आवश्यक हो, रिम के लिए वैक्यूम तेल लागू करने के लिए जगह में coverslip रखने. Coverslip के नीचे करने के लिए नमूनों को सीधे नीचे विसर्जन तेल, लागू करें. स्लॉट में माइक्रोस्कोप के मंच पर नमूना धारक डालें. विशेष देखभाल करने के उद्देश्यों को नहीं छूना. धारक को समायोजित करें तो यह तंग है और उद्देश्य के ऊपर वर्गों केन्द्रों. लगाएँ एक 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर वर्गों. 100x उद्देश्य लेंस में बदलें. नमूने पर ध्यान दें. संकेतों के प्रतिदीप्ति ताकत देख कर ब्याज की एक क्षेत्र का पता लगाएँ. 488 एनएम लेजर का उपयोग और 10% करने के लिए चैनल मेनू में तीव्रता में वृद्धि. प्रतिभाशाली प्रतिदीप्ति के क्षेत्रों पर ध्यान दें. ध्यान दें कि इस कदम के लिए आवश्यक नहीं है यदि क्षेत्र ओच ब्याज आंखों से उज्ज्वल क्षेत्र में पहचाना जा सकता है. 561 एनएम लेजर स्विच और 100% करने के लिए पृष्ठभूमि autofluorescence बाहर तीव्रता ब्लीच को बढ़ाने के लिए. ~ 2 मिनट के लिए नमूना ब्लीच. विरंजन के दौरान ध्यान यदि परिवर्तन, ध्यान समायोजन और छवियों पर कब्जा करने से पहले बिताना 5 मिनट की अनुमति देते हैं. इस विराम तापमान को स्थिर करने के लिए अनुमति देता है. यदि पाम गुंजाइश एक ऊष्मायन चैम्बर से सुसज्जित है, 20 के लिए तापमान सेट डिग्री सेल्सियस और ~ 2 घंटे के लिए प्रतीक्षा करने के लिए चैम्बर में तापमान को स्थिर. जब विरंजन पूरा हो गया है, 405 एनएम लेजर सक्रिय और यह सबसे कम तीव्रता के लिए सेट. 20 फ्रेम प्रति सेकंड पर एकत्रित शुरू करो. हम आम तौर पर प्रयोग प्रति 5,000-6,000 तख्ते जमा है, लेकिन तख्ते की संख्या प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, अगर ब्याज की एक क्षेत्र में सभी प्रोटीन imaged किया जाना चाहिए, फ्रेम संख्या में वृद्धि किया जाना चाहिए. यदि संकेतों विरल या बेहोश हैं, धीरे धीरे increaसे 405 एनएम लेजर तीव्रता. अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान ध्यान में ध्यान से आवश्यक के रूप में घुंडी समायोजन करके नमूने रखने के लिए सुनिश्चित हो. जब छवियों को एकत्र कर रहे हैं, पाम विश्लेषण किया जाना चाहिए. TdEos के लिए, हम किसी भी संकेत है कि अब 500 मिसे से प्रतिदीप्ति है क्योंकि उन संकेतों की संभावना के कारण autofluorescence फिल्टर. 6. SEM इमेजिंग पहले SEM इमेजिंग, 4 मिनट के लिए 2.5% uranyl एसीटेट (पानी में) का उपयोग करने वर्गों दाग. फ़िल्टर्ड milliQ पानी के साथ बंद पूरी तरह uranyl एसीटेट धो लें. बाद वर्गों सूख रहे हैं, कार्बन कोट एक कार्बन का उपयोग coverslip धूम तक coverslip काफी अंधेरा हो जाता है. Coverslip के किनारे और धातु ठूंठ पर दूसरे छोर पर कार्बन प्रवाहकीय टेप के एक छोर लागू इतना है कि इलेक्ट्रॉनों कि coverslip की सतह पर जमा पर आधारित हैं. SEM कक्ष (फी नोवा नैनो) में नमूना माउंट. वीसीडी डिटेक्टर डालें. </li> चैम्बर बंद करो और यह पंप उच्च वैक्यूम सेटिंग का उपयोग कर. एक बार खाली, स्तंभ वाल्व खोलने इतना है कि इलेक्ट्रॉन बीम एक नमूना करने के लिए लागू किया जाता है. इलेक्ट्रॉन बीम की एक नियमित संरेखण प्रदर्शन. नमूना पता लगाएँ. एक बार ध्यान निकाला जाता है, नमूना चरण लिंक और पोल टुकड़ा नीचे 5 मिमी लाने के मंच. नमूना (x ~ 5000) के एक कम बढ़ाई छवि ले लो. ज़ूम और ब्याज के क्षेत्र में उच्च वृद्धि प्राप्त छवियों (50,000 x). अगले अनुभाग पर ले जाएँ, और कदम 6.10) और 6.11) दोहराएँ जब तक सभी वर्गों imaged हैं. 7. Aligning पाम और EM छवियां ओपन Photoshop और अधिग्रहण छवियों SEM. 5000 x 5000 पिक्सल और 300 पिक्सल / इंच संकल्प के आयामों के साथ एक नई विंडो बनाएँ. नई विंडो (चित्रा 1 ए) में कम बढ़ाई SEM छवि को कॉपी. छवि पैमाने पर इतना है कि यह भरता हैपरिवरतित हेरफेर (+ कमान एक मैक के लिए टी) का उपयोग करके पूरे खिड़की. छवियों SEM उच्च बढ़ाई कॉपी और उन्हें आवश्यकतानुसार पैमाने. राशि TIRF छवि आड़ापलटें छवि ड्रॉप डाउन मेनू बार से छवि रोटेशन का चयन करके. कॉपी और राशि TIRF (पाम) छवि एक नई परत में पेस्ट कर सकते हैं. परिवरतित हेरफेर का उपयोग कर छवि पैमाने पर करने के लिए और फिर बारी बारी से रूप में इसी SEM में visualized संरचनाओं (चित्रा 1 बी) (चित्रा 1 ए में सफेद तीर) के साथ सोने के कणों की प्रतिदीप्ति मैच के लिए आवश्यक. पाम छवि एक नई परत में कॉपी और एक ही परिवर्तन (चित्रा 1C) लागू. एक उच्च बढ़ाई छवि इस छवि (2 चित्रा) से निकाला जा सकता है. प्रस्तुति के लिए, एक नई परत में तब्दील पाम छवि की प्रतिलिपि. "चुनें" ड्रॉप डाउन मेनू में "रंग रेंज" का उपयोग करके पाम संकेतों लेकिन नहीं पृष्ठभूमि का चयन करें. Sel के लिए सुनिश्चित करेंएक संदर्भ पिक्सेल के रूप में एक पृष्ठभूमि पिक्सेल ect और पलटना "विकल्प पर बारी. वांछित पाम संकेतों कट और उन्हें एक नई परत को चिपकाएँ. पृष्ठभूमि परत पारदर्शिता लागू, और यह 10% करने के लिए सेट. यह उनकी तीव्रता (चित्रा 2 डी) समझौता किए बिना पारदर्शी पृष्ठभूमि बनाकर खजूर के संकेतों के दृश्य के लिए अनुमति देता है. 8. प्रतिनिधि परिणाम TdEos के साथ टैग Histone stably निमेटोड सी में व्यक्त किया जा सकता है एलिगेंस, और ट्रांसजेनिक जानवर ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग संसाधित थे. पाम और इलेक्ट्रॉन micrographs एक ही खंड (1 चित्रा) से हासिल किया गया. चित्र संरेखित, राशि TIRF छवि, जो पूरे समय पाठ्यक्रम पर प्रतिदीप्ति राशियाँ इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ पर मढ़ा है. सोने के नैनोकणों दोनों प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रॉन micrographs में दिखाई देते हैं और दो छवियों का उपयोग कर 'transf संरेखित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैफ़ोटोशॉप में orm 'समारोह (चित्रा 1 ए और बी). फिर, 'एक ही परिवरतित' मूल्य पाम छवि (चित्रा 1C) को लागू किया गया था. इस बढ़ाई, संरचनात्मक विस्तार नहीं किया जा प्रतिष्ठित कर सकते हैं तो हम माइक्रोग्राफ (2 चित्रा) के शीर्ष के अंत के निकट एक क्षेत्र में तेजी से बढ़ी है. उच्च बढ़ाई छवि में एक नाभिक nucleolus, परमाणु pores, और endoplasmic जालिका के रूप में subcellular विवरण देखा जा सकता है. इसके अलावा, विशेष रूप से टैग Histone अणुओं नाभिक को स्थानीय कर रहे हैं, लेकिन नहीं nucleolus, के रूप में की उम्मीद है. correlative पाम और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इस प्रकार सर्वोच्च संकल्प प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है. पांच समस्याओं छवियों की गुणवत्ता के साथ समझौता कर सकते हैं. सबसे पहले, बर्फ क्रिस्टल क्षति फैटी बिगाड़ना (चित्रा 3 ए और बी) कर सकते हैं. एक इस तरह के रूप में क्रायो protectant बैक्टीरिया, जो बर्फ क्रिस्टल के प्रसार को कम कर देता है में नमूनों रखकर इस नुकसान को कम कर सकते हैं. फिर भी,एक अभी भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा नमूनों स्क्रीन चाहिए और ठंड कलाकृतियों के साथ उन त्यागें. दूसरा, GMA epoxy रेजिन जैसे ऊतकों को नहीं पार से लिंक करता, और इस प्रकार नमूनों अक्सर आसपास के प्लास्टिक और खिंचाव से ढीला तोड़, हटना या भी खंड (चित्रा -3 सी और डी) के बाहर गिर. Embedding पहले क्रायो protectant बैक्टीरिया या अन्य से दूर नमूना के विच्छेदन नमूना (चित्रा -3 सी) के लिए प्लास्टिक की अधिक से अधिक आसंजन के लिए प्रदान करता है. इसी तरह, पेट में लिपिड बूंदों के रूप में ऐसी संरचनाओं अक्सर पार से जोड़ने (3E चित्रा) के अभाव के कारण ऊतकों से अलग कर देना. तीसरा, प्लास्टिक खींच या ऊतकों की तह कारणों का अधूरा polymerization (3F चित्रा), नमूने में ऑक्सीजन की उपस्थिति भी GMA के polymerization में बाधा उत्पन्न करती है. चौथा, GMA के गरीब सेक्शनिंग गुणवत्ता अक्सर एक असंगत आकारिकी (चित्रा 3 जी और एच) में यह परिणाम है. GMA वर्गों में कटौती की जानी चाहिए70 एनएम या मोटा और कम करने के लिए चारों ओर 1.6 मिमी / एस के एक गति से कलाकृतियों सेक्शनिंग. पांचवां, धूल से coverslip या अनुभाग पर पृष्ठभूमि autofluorescence अनिवार्य है. धूल से Autofluorescence पूर्व साफ coverslips और kimwipes और फिल्टर पेपर से धूल संदूषण से बचने के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग करके कम किया जा सकता है. पाम विश्लेषण प्रोग्राम नमूना या प्लास्टिक है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन से विशिष्ट संकेत (2 चित्रा ए और बी) की तुलना में लंबे समय तक प्रतिदीप्ति से संकेत संपादित कर सकते हैं. अंतिम छवि इसलिए ऐसी कलाकृतियों के मुक्त हो जाएगा. चित्रा 1 प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रॉन micrographs Aligning सोने के नैनोकणों का उपयोग. (ए) सी. के एक क्रॉस सेक्शन से कम बढ़ाई इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ टैग histone tdEos व्यक्त एलिगेंस :: HIS-11. व्हाइट एकrrows 100 एनएम इलेक्ट्रॉन घने सोना पाम इमेजिंग कि विश्वस्त के निशान के रूप में सेवा करने के लिए पहले से लागू नैनोकणों से संकेत मिलता है. (बी) सोने की माला ~ 580 एनएम प्रकाश के लिए जोखिम पर प्रतिदीप्ति और प्रतिदीप्ति छवि मापकला अंक बनाने के. राशि TIRF छवि एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ पर मापकला के निशान के स्थान के आधार पर गठबंधन किया है. राशि TIRF छवि प्रयोगात्मक समय के दौरान कैमरा के द्वारा पाया फोटॉनों का प्रतिनिधित्व करता है. ध्यान दें कि ऊपरी बाएँ (सफेद तीर) पर चमकीले धब्बों सोने के कणों के समूहों से उत्पन्न होती हैं. (सी) एक पाम छवि तो इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ और घुमाया जोड़ा जाता है और (बी) में योग TIRF छवि के संरेखण से निर्धारित मूल्यों पर आधारित अनुवाद. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . <br /> चित्रा 2. नैनो फेम correlative histone संलयन प्रोटीन का उपयोग. TdEos का योग (ए) TIRF छवि :: HIS-11 एक पतली धारा (70nm) से प्राप्त. (बी) के अनुरूप पाम छवि tdEos :: HIS-11. Autofluorescence (सफेद तीर) स्थायी अब की तुलना में 500 मिसे पाम कार्यक्रम द्वारा फ़िल्टर किया गया था. (सी) एक नाभिक के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ एक ही अनुभाग से प्राप्त कर लिया. (D) correlative पाम छवि और tdEos के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ :: HIS-11. प्रतिदीप्ति कसकर नाभिक में chromatin के लिए स्थानीय है. चित्रा 3 नैनो फेम के साथ जुड़े समस्याएं. (ए) एक सी. के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ एलिगेंस बर्फ क्रिस्टल क्षति के बिना शरीर की मांसपेशियों. (बी) क्रिस्टल बर्फ क्षति के साथ एक शरीर की मांसपेशियों की इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ. असतत वर्गों के बजाय, actin और मायोसिन filaments बर्फ क्रिस्टल के गठन के कारण समुच्चय में गिर रहे हैं. (सी, डी) कम बढ़ाई इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफहै, आसपास के मीडिया से कीड़े की हदबंदी दिखा. अनुभाग एक नमूना है कि क्रायो बैक्टीरिया की रक्षा (डी) द्वारा जब नमूना प्लास्टिक (सी) से घिरा हुआ है से घिरा हुआ है में और अधिक विकृत है. बैक्टीरिया gallette में क्रायो protectant प्लास्टिक embedding से पहले निश्चित नमूना से दूर dissected चाहिए. ध्यान दें कि (डी) में सही पर पशु sectioned obliquely था, और इस तरह आकार ऊतकों के विरूपण के कारण नहीं है. (ई) आंत की इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ, ऊतकों की dropouts (काला तीर) दिखा. (एफ) तंत्रिका अंगूठी इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ, प्लास्टिक की अधूरी polymerization (काला तीर) के कारण वर्गों की तह दिखा. (जी, एच) एक ही नमूना से न्यूरॉन्स की इलेक्ट्रॉन micrographs, अलग तारीखों पर sectioned. ऊतकों के संरक्षण के एक दिन (G) शानदार है, लेकिन ऐसी morphology असंगत सेक्शनिंग गुणवत्ता (एच) द्वारा अस्पष्ट है. वी करने के लिए यहाँ क्लिक करेंiew बड़ा आंकड़ा है.

Discussion

यहाँ हम वर्णन कैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन की रक्षा करने के लिए प्लास्टिक में, वर्गों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्थानीयकरण, और छवि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग फैटी. प्रोटीन विवर्तन nanometer संकल्प पाम माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सीमा से नीचे स्थानीयकृत किया गया. विशेष नमूनों को इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए, निम्न मापदंडों पर विचार किया जाना चाहिए: fluorophore, संरेखण, और मात्रा का ठहराव.

फ्लोरोसेंट प्रोटीन या जैविक fluorophore के पसंद आवेदन और मॉडल प्रणाली पर निर्भर करता है. हम EGFP, YFP, सिट्रीन, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, पीए mCherry, और Dendra ¹² सहित, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक किस्म का परीक्षण किया है. प्रत्येक fluorophore से प्रतिदीप्ति के संरक्षण के समान था, सुझाव है कि सभी फ्लोरोसेंट प्रोटीन वर्णित विधि का उपयोग कर संरक्षित किया जा सकता है. हम tdEos चुना क्योंकि यह अच्छी तरह से व्यक्त सी. में एलिगेंस, कार्यात्मक प्रोटीन बने रहे जब tdEos से इनकार, और इसकी वजह सेफोटो सक्रियण विशेषताओं पाम माइक्रोस्कोपी के लिए इष्टतम थे. हालांकि, tdEos का एकत्रीकरण या असफल अभिव्यक्ति कभी कभी किया गया है ^{12 मनाया.}

आवेदन के आधार पर, एक अलग fluorophore बेहतर अनुकूल हो सकता है. कई मामलों में, यह एक फोटो सक्रिय फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है. सरल correlative प्रतिदीप्ति इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी फोटो सक्रिय फ्लोरोसेंट प्रोटीन की आवश्यकता नहीं है. GFP या सीमा विवर्तन ऊपर वर्गों में टैग प्रोटीन से कार्बनिक रंजक छवि प्रतिदीप्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक छवि एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग neuropil में एक अक्षतंतु और इमेजिंग द्वारा एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में विशेष रूप से एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रतिदीप्ति अक्षतंतु साथ प्रतिदीप्ति संकेत सहसंबंधी कर सकते हैं. प्रेरित उत्सर्जन रिक्तीकरण (STED) माइक्रोस्कोपी ^12, जमीन राज्य कमी व्यक्तिगत अणु (GSDIM) वापसी ¹³ से बाद माइक्रोस्कोपी, और जैसे अन्य सुपर संकल्प तकनीक,संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) ^14, फोटो सक्रिय फ्लोरोसेंट प्रोटीन की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, सुपर संकल्प इमेजिंग तकनीक है कि जैविक में ^9,15,16 रंगों या फ्लोरोसेंट ¹⁷ जांच की आंतरिक संपत्ति का उपयोग आसानी से लागू कर रहे हैं.

हथेली में अणुओं की संख्या क्योंकि प्रत्येक अणु प्रतिदीप्ति spatially और अस्थायी रूप से अलग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. ऑक्सीकरण, undercounting, overcounting, और overexpression: हालांकि, मात्रा का ठहराव चार कारणों के लिए गुमराह किया जा सकता है. सबसे पहले, फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक अंश या विकृत किया जा सकता है नमूना प्रसंस्करण ^5,12 दौरान ऑक्सीकरण हो जाता है. हालांकि ~ प्रतिदीप्ति संकेत के 90% निर्धारण और हमारे प्रोटोकॉल में embedding के माध्यम से संरक्षित किया गया था, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के ऑक्सीकरण के बाद नमूना sectioned किया गया है और सतह ऑक्सीजन के संपर्क में हो सकता है. दूसरा, तस्वीर – सक्रिय प्रोटीन की सक्रियता stochastic है, और इस प्रकार कई अणुओं हो सकता हैएक दिया विवर्तन सीमित ⁸ हाजिर में सक्रिय है. कई अणुओं से प्रतिदीप्ति एक मौके के रूप में दिखाई देगा, और इस प्रकार प्रोटीन की कुल संख्या undercounted जाएगा. तीसरा, एक ऐसी ही समस्या overcounting करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हथेली में, प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन और स्थानीय विरंजन द्वारा फिर "मिट". हालांकि, फ्लोरोसेंट प्रोटीन अंधेरे राज्य से स्थायी रूप से प्रक्षालित किया जा रहा है ^{18 के} बिना लौट सकते हैं. ऐसे अणुओं तो कई बार गिना जाएगा. चौथा, टैग प्रोटीन transgenes के रूप में व्यक्त किया जाता है और अक्सर कई प्रतियां, जो overexpression लिए नेतृत्व कर सकते में उपस्थित. इसलिए, हथेली से मात्रा का ठहराव का अनुमान लगाने के, लेकिन निर्धारित ठीक नहीं दिए गए स्थान में अणुओं की संख्या करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ के साथ एक पाम छवि के संरेखण भी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन बीम के कारण विरूपण संकल्प में अंतर की वजह से चुनौतीपूर्ण जा सकता है. सोने के कणों के रूप में नियंत्रण रेखा कसकर में सेवा करते हैंalized इलेक्ट्रॉन micrographs मापकला मार्करों. हालांकि, सोने के कणों से fluoresecence फोटो सक्रिय नहीं है, और एक बड़ी जगह विवर्तन सीमित रूप में प्रकट होता है. इस प्रकार, एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ पर एक प्रतिदीप्ति छवि की नियुक्ति एक अनुमान है. विकृतियों भी इलेक्ट्रॉनों की प्लास्टिक अनुभाग के साथ बातचीत से भी पैदा कर सकते हैं. GMA जैसे ऐक्रेलिक रेजिन इलेक्ट्रॉन बीम के तहत कम स्थिर रहे हैं, और प्लास्टिक के आयामों को बदला जा सकता है. इन परिस्थितियों में, फैटी साथ प्रतिदीप्ति aligning मापकला मार्करों के गैर रेखीय परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है.

Materials

Name of the reagent or equipment	Company	Catalog number	Comments
High-pressure freezer	ABRA	HPM 010	EMPact and HPM 100 from Leica or hpf-01 from Wohlwend can also be used.
Automated freeze substitution unit	Leica	AFS 2	AFS 1 can also be used.
Zeiss PALM	Zeiss	ELYRA P.1	Nikon and Vutara also sell commercial PALM microscopes.
Scanning electron microscope	FEI	Nova nano	Other high-resolution SEM microscopes can be used.
Acetone	EMS	RT10016
Ethanol	Sigma-aldrich	459844-1L
Osmium tetroxide	EMS	RT19134
Potassium permanganate	EMS	RT20200
Albumin from bovine serum	Sigma-aldrich	A3059-50G
Uranyl acetate	Polysciences	21447-25	pH of uranyl acetate from this company is slightly higher.
Glycol methacrylate (GMA)	SPI	02630-AA	Low acid, TEM grade.
N,N-Dimethyl-p-toluidine	Sigma-aldrich	D9912
Cryo vials	Nalgene	5000-0020
Glass vials	EMS	72632
Aclar film	EMS	50425-10
BEEM capsule	EBSciences	TC	Polypropylene
3/8″ DISC punches	Ted Pella	54741
Gold nanoparticles	microspheres-nanospheres.com	790122-010	Request 2x concentrated solution