झिल्ली macromolecular क्रिस्टलोग्राफी द्वारा संरचना निर्धारण के लिए lipidic Mesophases में बढ़ी प्रोटीन की कटाई और क्रायो ठंडा कण

Summary

के साथ साथ Caffrey स्ट्रक्चरल और फसल और क्रायो शांत झिल्ली प्रोटीन संरचना macromolecular क्रि एक्स – रे का उपयोग कर निर्धारण में उपयोग के लिए lipidic घन और स्पंज चरणों में हो क्रिस्टल कार्यात्मक बायोलॉजी समूह झिल्ली में लागू प्रक्रियाओं का वर्णन है.

Abstract

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases^1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field^6-21 (www.mpdb.tcd.ie). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting^22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)^24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.

The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies^4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Protocol

1. प्रयोगशाला के पूर्व कटाई सेट अप कटाई के लिए तैयार करने में, तरल नाइट्रोजन के साथ सूखी फोम देवर को भरने और यह माइक्रोस्कोप जहां कटाई करने के लिए जगह नहीं ले रहा है के बगल में जगह. डूब पक भंडारण, अंत खोलने के लिए, फोम देवर अंदर तरल नाइट्रोजन में है और यह पूरी तरह से शांत करने की अनुमति दें. एक एक आकार है कि एक चुंबकीय छड़ी (5 चित्रा) पर काटा जा क्रिस्टल मैचों की सूक्ष्म माउंट सुरक्षित. यह महत्वपूर्ण है कि हाथ पर स्पेयर चुंबकीय माइक्रो आरोह साथ preloaded स्थितियों के लिए पूरा करने के लिए जहां यह आवश्यक है एक सांस से कई क्रिस्टल फसल wands के एक नंबर है. स्पेयर wands सभी समय पर उपलब्ध होना चाहिए. जगह एक micropipette, सुझावों और शीघ्र समाधान के लिए है कि क्रिस्टल कटाई माइक्रोस्कोप अगले विकास के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह mesophase को कवर करने के लिए और सुखाने जब अच्छी तरह से खोला जाता है को रोकने की जरूरत हो सकती है. क्या एक और बेंच पर नोटबुक कलम द्वारा बंद और / याकंप्यूटर खुला. ये गुणवत्ता, उपस्थिति, स्थान, भंडारण, पक संख्या, क्रिस्टल, आदि के बारे में टिप्पणियों के रूप में वे काटा, क्रायो – ठंडा और भंडारण में रखा रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. यदि एक सहायक कटाई है कि व्यक्ति को स्पष्ट रूप से प्रोटोकॉल है कि पीछा किया जाएगा, ताकि जो विभिन्न चरणों में जगह ले जाएगा, और समग्र प्रक्रिया में अपनी भूमिका को समझना चाहिए के साथ मदद के लिए उपलब्ध है. जगह में सामग्री और उपकरणों के सभी के साथ हमारे अगले काम के लिए है: 2. प्लेट्स और वेल्स होते क्रिस्टल को पहचानें harvestable क्रिस्टल को खोजने के लिए सरल और सबसे प्रत्यक्ष विधि सामान्य और पार कर polarized प्रकाश के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हाथ से कुओं का निरीक्षण करने के लिए है. खुर्दबीन पर रोशन प्रकाश की तीव्रता समायोजन क्रिस्टल लगाने के साथ मदद कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, एक imager जहां प्लेटें स्वचालित रूप से सामान्य के साथ जांच कर रहे हैं और फूट डालना को पार करघ प्रकाश, क्रिस्टल के लिए देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आंख से मूल्यांकन एक कंप्यूटर मॉनीटर पर डिजिटल छवियों को दर्ज की गई. आकार, गुणवत्ता और नोटबुक में mesophase में या एक कंप्यूटर पर क्रिस्टल के स्थान पर कटाई और रिकॉर्ड टिप्पणी के लिए क्रिस्टल के साथ स्पष्ट रूप से उन कुओं निशान. Imager से कटाई के लिए क्रिस्टल युक्त थाली निकालें. 3. घन mesophase के साथ एक अच्छी तरह से खोलना. विधि 1 प्लेट जिसमें क्रिस्टल द्वारा meso विधि में बढ़ने कांच सैंडविच प्लेट (2 चित्रा) हैं. आदेश में mesophase और उसमें क्रिस्टल का उपयोग करने के लिए है, यह अच्छी तरह से खुला करने के लिए आवश्यक है. यह एक कांच काटने के उपकरण का उपयोग करने के लिए ऊपरी coverglass कि जवानों अच्छी तरह से है जो फिर से हटाया जा सकता है में कटौती के द्वारा किया जाता है. वहाँ काटने और अच्छी तरह से एक crystallization coverglass को हटाने के लिए कई दृष्टिकोण हैं. उपयोग करने के लिए एक प्रकार ओ से निर्धारित होता हैजो में च mesophase क्रिस्टल बढ़ पाया है. यह बहुत चिपचिपा और चिपचिपा घन चरण (चित्रा 3 ए) या ​​उसके अधिक तरल पदार्थ संस्करण स्पंज चरण (3B चित्रा) हो सकता है. इस वीडियो लेख में हम बताएंगे कि कैसे कुओं को खोलने के लिए और इन होस्टिंग सामग्री के दोनों से क्रिस्टल फसल. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के मंच पर कांच सैंडविच crystallization प्लेट रखें. एक कांच काटने के उपकरण स्कोर coverglass हल्के का उपयोग दो स्पेसर ऊपर और बस अच्छी तरह से की परिधि के बाहर स्थित गाढ़ा हलकों के साथ. एक नए काटने के उपकरण के साथ, स्कोरिंग कम दबाव लागू की आवश्यकता है. जब स्कोर करने के लिए आवश्यक दबाव fractionally भी बढ़ जाती है एक नया एक के साथ बदलें उपकरण, यह आमतौर पर 10 कुओं के उद्घाटन के बाद होता है. भीतरी coverglass जारी करने के उद्देश्य के लिए दो रन हलकों के बीच अंतरिक्ष में कांच तोड़. इस गिलास shards और धूल के बहुत से उत्पन्न है. उन्हें एक सिक्त के साथ दूर साफ़कागज तौलिया. यह एक ठीक इत्तला दे दी चिमटी और इसे दूर झुकने के साथ मनोरंजक और अच्छी तरह से बंद करके मुक्त coverglass निकालें. इस मामले में, घन चरण अटक रहता है और अच्छी तरह से baseplate पर जगह. में ज़ूम करने के लिए घन mesophase की एक स्पष्ट विचार है जो अब है क्रिस्टल कटाई में उपयोग के लिए तैयार है. 4. घन Mesophase के साथ एक अच्छी तरह से खोलना. विधि 2 Coverglass में अच्छी तरह से एक तरफ करने के लिए और अच्छी तरह से भर में ही विस्तार है कि कांच काटने के उपकरण सीधे समानांतर लाइनों स्कोर का उपयोग. यह आसान चिमटी का उपयोग और coverglass को हटाने के लिए सक्षम बनाता है. इस विशेष प्रदर्शन में, coverglass चिपचिपा स्पेसर सतह से coverglass मुक्त में दरारें. इस प्रक्रिया में, coverglass स्थिति में बदलाव और तेज़ घन चरण से अलग करती है. जब coverglass उठाया है तेज़ की कुछ के साथ चला जाता है. हम एक उजागर ख के साथ छोड़ दिया जाता हैकिसी भी आसपास के तेज़ बिना mesophase की olus. तत्काल, एक बाहर सुखाने और है जो क्रिस्टल को नुकसान हो सकता है एक चरण परिवर्तन के दौर से गुजर से mesophase को रोकने के लिए एक micropipette का उपयोग सांस के शीर्ष पर μl ताजा तेज़ जोड़ने. सांस में अब के लिए क्रिस्टल कटाई में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है. 5. स्पंज चरण के साथ एक अच्छी तरह से खोलना. असफल स्पंज चरण कम क्योंकि उसके प्रवाह करने की क्षमता के साथ काम करने के लिए क्षमा है. यदि स्पंज चरण अच्छी तरह केशिकत्व की परिधि से संपर्क में है कि प्रवाह परिणाम mesophase आकर्षित और क्रिस्टल खो जाएगा. यह हो रहा है की एक उदाहरण इस वीडियो क्लिप में दिखाया गया है. स्पंज चरण पर ज़ूम और सामान्य और पार polarized प्रकाश के बीच आगे और पीछे स्विच स्पंज चरण में क्रिस्टल का पता लगाने. अच्छी तरह से स्कोर खोलने और coverglass कटौती के रूप में धारा 3 में वर्णित करने के लिए तैयार करने में. इस प्रक्रिया में, coverglass दरारें. के प्रयास मेंको अच्छी तरह से दरार की दिशा में शीघ्र बदलाव खोल रही है और अंत में यह स्पेसर साथ संपर्क में आता है. साथ तेज़ स्पंज चरण और क्रिस्टल जो खो रहे हैं की अपनी कार्गो के कुछ चला जाता है. इस विशेष क्रम में, माइक्रोस्कोप पर polarizers और पूरी तरह से नहीं पार कर रहे हैं क्रिस्टल उज्ज्वल वस्तुओं के रूप में एक ही समय में देखा जा सकता है कि अच्छी तरह से और अपनी सामग्री दिखाई देती रहेंगी. 6. स्पंज चरण के साथ एक अच्छी तरह से खोलना. सफलतापूर्वक स्पंज चरण पर ज़ूम और सामान्य और पार polarized प्रकाश में दोनों एक क्रिस्टल की पहचान. स्कोर में कटौती, और coverglass की 4.1 धारा में के रूप में अच्छी तरह से एक अनुभाग को कवर निकालने के लिए,. अधूरे को पार कर polarized प्रकाश क्रिस्टल का ट्रैक रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. Coverglass में खोलने के माध्यम से और अच्छी तरह से में सूखी टिशू पेपर के एक टुकड़े का परिचय जब तक यह सिर्फ छू शीघ्र समाधान. दूर सावधान समाधान बातीly जब तक यह लगभग सभी और चला गया है तो ऊतकों को हटाने के. यह शेष तेज़ और स्पंज चरण का कारण बनता है, क्रिस्टल के साथ अभी भी जगह में, coverglass तहत वापस लेना. स्कोर में कटौती, और 4.1 धारा में coverglass के बाकी चिमटी से दूर. इस मामले में, स्पंज चरण विभाजन, कुछ अच्छी तरह से और कुछ चिपक जाती है coverglass के लिए रहता है. क्रिस्टल coverglass पर सांस में है. क्योंकि वहाँ बहुत थोड़ा तेज़ मौजूद है, स्पंज चरण के लिए एक चरण की संभावना बाहर सुखाने के कारण संक्रमण से गुजरना शुरू होता है. यह birefringence की एक अंगूठी कि सांस के केंद्र की ओर migrates के रूप में देखा जा सकता है. तुरंत सांस तेज़ जोड़ने के लिए संक्रमण को रोकने के लिए. सांस में अब क्रिस्टल कटाई में उपयोग के लिए तैयार है. 7. संचय और घन चरण से क्रायो ठंडा क्रिस्टल सामान्य और पार polarized प्रकाश के बीच आगे और पीछे जाने के लिए खुले कुएं में घन चरण सांस में क्रिस्टल का पता लगाने. टी मेंअपने वीडियो चार बाइरैफ्रिन्जेंट क्रिस्टल अनुक्रम पार कर polarized प्रकाश के साथ घन चरण सांस में देखा जा सकता है. क्रायो पाश (चित्रा 5) क्रिस्टल के लिए हौसले से उजागर mesophase की जांच करने के लिए, बाहर क्रिस्टल मछली और फिर उन्हें डुबकी, क्रायो – पाश में निहित, देवर में तरल नाइट्रोजन में कटाई पर तुरंत घुड़सवार का प्रयोग करें. आदर्श रूप में, संचयन और तस्वीर ठंडा एक सतत और तेजी से गति में होना चाहिए. जितना संभव हो कम पालन mesophase क्रिस्टल के साथ काटा जाना चाहिए. हमारे अनुभव में, क्रायो – protectant में meso हो क्रिस्टल के साथ की जरूरत नहीं है. चूंकि यह संभव क्रायो – पाश में क्रिस्टल के लिए mesophase को सत्यापित करें कि क्रिस्टल अब वहाँ नहीं है सुझाव है कि इसे सफलतापूर्वक काटा गया था कटाई के लिए इस्तेमाल सांस निरीक्षण कटाई के तुरंत बाद नहीं लग रही है. 8. स्पंज चरण से संचयन और क्रायो ठंडा कण सामान्य और पार polarized प्रकाश के बीच आगे और पीछे जाने के लिए खुले कुएं में स्पंज चरण सांस में क्रिस्टल का पता लगाने. इस वीडियो अनुक्रम में कई बाइरैफ्रिन्जेंट क्रिस्टल पार कर polarized प्रकाश के तहत सांस में देखा जा सकता है. एक क्रायो – पाश (5 चित्रा) बाहर मछली स्पंज चरण से क्रिस्टल और उन्हें डुबकी में या cryoloop पर निहित, देवर में तरल नाइट्रोजन में कटाई पर तुरंत घुड़सवार. का प्रयोग करें घन चरण से कटाई के साथ के रूप में, आदर्श, क्रायो ठंडा प्रक्रिया तुरंत हो क्रिस्टल वास्तविक कटाई घटना के बीच elapsing और तरल नाइट्रोजन में डूबनेवाला संभव के रूप में कम समय के साथ काटा जाता है. के रूप में छोटे पालन संभव के रूप में स्पंज चरण क्रिस्टल के साथ काटा जाना चाहिए. के रूप में उल्लेख किया है, क्रायो – protectant में meso हो क्रिस्टल के साथ की जरूरत नहीं है. 9. Dewars में कण भंडारण तरल नी में घुड़सवार पाश डूबtrogen यह एक फोम में भंडारण पक देवर की होल्डिंग स्लॉट में से एक में जगह है. सभी जोड़तोड़ पाश के साथ किया जाता है, चुंबकीय छड़ी और पक के शीर्ष तरल नाइट्रोजन में डूबे हुए हैं. स्थान और harvested का विवरण और नोटबुक और / या कंप्यूटर पर क्रायो – कूल्ड क्रिस्टल रिकार्ड. जब फोम देवर में पक पूर्ण या कटाई के लिए दिन एक भंडारण या एक परिवहन देवर में एक हटाया पक धारक में पक स्थानांतरण पूर्ण है तरल नाइट्रोजन के साथ भर दिया. कण परिवहन Dewars में सुविधा सिंक्रोटॉन विवर्तन डेटा संग्रह के लिए भेज दिया जा सकता है. 10. प्रतिनिधि परिणाम संचयन और क्रायो ठंडा अभ्यास के उद्देश्यों का प्रदर्शन यहां क्रायो – loops में मेजबानी mesophase से क्रिस्टल स्थानांतरित looped क्रिस्टल शीशे सा बनना और एक देवर में तरल नाइट्रोजन में भंडारण में यह जगह. आदर्श स्थिति है, जहां कटाई और गryo ठंडा इस तरह है कि क्रिस्टल विवर्तन गुणवत्ता प्रक्रिया में संरक्षित है में किया जाता है. जितना संभव हो कम mesophase क्रिस्टल के साथ काटा जाना चाहिए. यह क्रिस्टल लगाने और यह एक्स – रे बीम में है कि बहुत कम चुनौतीपूर्ण केंद्रित vitrification के लिए एक दृश्य के साथ क्रायो – ठंडा, गति और विवर्तन डेटा संग्रह के दौरान पृष्ठभूमि mesophase से तितर बितर हस्तक्षेप को कम करने के लिए है. क्रायो कूल्ड नमूने जहां क्रिस्टल देखा जा सकता है सकते हैं और नहीं के कुछ उदाहरण चित्रा 6 में दिखाए जाते हैं. कहाँ क्रिस्टल आंखों से नहीं देखा जा सकता है यह आम तौर पर आवश्यक विवर्तन rastering का सहारा क्रम में क्रिस्टल खोजने के लिए और 27 डेटा संग्रह के लिए यह केंद्र बीम में. चित्रा 1 की गिरफ्तारी में और जिस पर एक जैविक लिपिड bilayer दिखा झिल्ली के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.ई प्रोटीन की एक किस्म स्थित है. चित्रा 2 एक पूरी तरह से भरा हुआ है और सील 96-अच्छी तरह से कांच सैंडविच crystallization थाली. हर अच्छी तरह से 50 nl घन चरण और 1 μl शीघ्र समाधान शामिल हैं. स्पष्टता के लिए, घन चरण सूडान लाल के साथ किया गया दाग और शीघ्र समाधान Methylene ब्लू शामिल हैं. संदर्भ से 5. चित्रा 3 झिल्ली lipidic mesophase में बढ़ती प्रोटीन के कण. एच. से bacteriorhodopsin की एक क्रिस्टल के साथ घन चरण स्पंज halobium बी विटामिन बी 12 / रिसेप्टर ट्रांसपोर्टर, BtuB के एक क्रिस्टल युक्त ई. से चरण, कोलाई. संदर्भ से 25. घन और स्पंज चरणों appea विषम हैrances पैनलों की तुलना द्वारा स्पष्ट है और एक बहुत चिपचिपा है और बरकरार रखती है अपने मूल आकार में घन चरण बी. यह प्रवाह नहीं. यह mesophase सांस है कि एक roughened उपस्थिति के किनारों पर विशेष रूप से स्पष्ट है. अनुबंध, स्पंज चरण काफी कम चिपचिपा है और प्रवाह करता है. इस प्रकार, स्पंज चरण के लिए अपने मूल आकार को बनाए रखने में विफल रहता है और इसके किनारों विशेषता चिकनी हैं. Precipitants है कि Jeffamine शामिल हैं, 400 खूंटी, 2 – मिथाइल-2 ,4-pentandiol, pentaerythritol, butanediol propoxylate और hexanediol, घन से स्पंज 4,26 चरण के लिए एक संक्रमण में परिणाम कर सकते हैं. चित्रा 4. फ्लोचार्ट उत्पादन, कटाई, और क्रायो – ठंडा meso हो झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल में (ए) में शामिल कदम का सार है. केवल उन डैश्ड लाल से घिरा कदमलाइन, और (बी) में विस्तार से वर्णित है, इस जौव लेख में कवर कर रहे हैं. पैनल 3 संदर्भ में से एक है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . 5 चित्रा एक खाली क्रायो – पाश एक पिन कि एक चुंबकीय छड़ी पर जगह में आयोजित किया जाता है पर मुहिम शुरू की. पिन (A) और सूक्ष्म माउंट विस्तारित विचार (बी) के संचयन और क्रायो – ठंडा करने के लिए इस महत्वपूर्ण उपकरण के दिखाए जाते हैं. बी में सूक्ष्म माउंट के अंत में खाली पाश व्यास में 30 सुक्ष्ममापी है. जबकि अन्य पाश प्रकार बड़े पैमाने पर परीक्षण नहीं किया है, हम पाते हैं कि MiTeGen घन और स्पंज दोनों चरणों के साथ दिखाया काम अच्छी तरह से loops. क्रायो – loops के रूप में एक सिंक्रोटॉन beamline पर एक लाइन में माइक्रोस्कोप के साथ देखा जा सकता है. ए, बी में झिल्ली प्रोटीन के चित्रा 6. काटा और क्रायो – कूल्ड क्रिस्टल काटा क्रिस्टल (caa3 साइटोक्रोम oxidase 34 (ए) के उदाहरण, diacylglycerol kinase, DgkA (बी)) जहां क्रिस्टल (नीले तीर) क्रायो – पाश जहां harvested क्रिस्टल एक क्रायो – पाश पर क्रायो कूल्ड mesophase में दिखाई नहीं है की सी. उदाहरण पर क्रायो कूल्ड mesophase के माध्यम से दिखाई दे रहे हैं. पाश की नोक एक लाल तीर के साथ की पहचान की है. पालन ​​क्रायो कूल्ड mesophase एक नीले तीर के साथ पहचान की है.

Discussion

हम लेख में इस वीडियो का प्रदर्शन कैसे एक lipidic mesophase में हो क्रिस्टल और काटा क्रायो – विवर्तन डेटा संग्रह में उपयोग के लिए तैयार करने में और अंततः संरचना के निर्धारण के लिए ठंडा. होस्टिंग mesophase चिपचिपा और चिपचिपा घन चरण या अधिक तरल पदार्थ स्पंज ⁴ चरण हो सकता है. कैसे गिलास सैंडविच प्लेटें खोले जाते हैं और कैसे क्रिस्टल बहुत बहुत काटा जाता mesophase प्रकार पर निर्भर करता है. यह इसलिए महत्वपूर्ण है पता करने के लिए जो दो एक के साथ काम कर रहा है समय के आगे. होस्टिंग लिपिड और तेज़ की पहचान इस संबंध में महत्वपूर्ण हैं, और crystallization में mesophase सांस की शारीरिक उपस्थिति अच्छी तरह से करने के लिए उन्हें अलग बता इस्तेमाल किया जा सकता है (3 चित्रा). दोनों mesophase प्रकार से फसल काटने वाले इस लेख में सचित्र था.

ग्लास सैंडविच प्लेटों में एक lipidic mesophase से छोटे क्रिस्टल फसल काटने वाले एक श्रमसाध्य प्रक्रिया है कि समय, कौशल, अनुभव की आवश्यकता हैience धैर्य, और एक स्थिर हाथ. यह महत्वपूर्ण है कि एक तरफ एकत्रित करने के लिए समय का एक उचित मात्रा सेट और प्रयोगशाला को स्थापित करने के लिए इतना है कि सभी सामग्री और उपकरण अग्रिम में हाथ में हैं. कटाई के साथ सहायता के लिए एक दूसरे व्यक्ति के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन सिफारिश की है. उस व्यक्ति व्यक्तिगत कटाई कर रही पूर्व चिह्नित प्लेटों की आपूर्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भंडारण पक में काटा क्रिस्टल के साथ क्रायो कूल्ड घुड़सवार loops रखने के साथ मदद कर सकते हैं. सहायक भी कटाई कि विवर्तन डेटा संग्रह के दौरान महत्वपूर्ण साबित हो सकता है के दौरान बनाया क्रिस्टल पर टिप्पणियों का दस्तावेजीकरण में एक महत्वपूर्ण समर्थन भूमिका निभा सकते हैं. एक सहायक के अभाव में, एक आवाज सक्रिय ऑडियो रिकॉर्डिंग डिवाइस प्रलेखन के लिए लाभ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद Viewer पाने के लिए और क्रिस्टल कटाई के साथ चल रहा है में मदद मिलेगी. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सराहना करते हैं कि इस प्रक्रिया को सरल और नहीं है कि प्राctice मूल्यवान झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल कटाई में शुरू करने से पहले की जरूरत है. इसलिए यह सिफारिश की है कि प्रोटीन है कि विशेष रूप से महत्वपूर्ण नहीं हैं के क्रिस्टल के साथ परीक्षण प्लेट 1 के साथ प्रयोग किया जा है. इस कांच को काटने में मूल्यवान अनुभव के साथ नौसिखिया प्रदान करेगा, गिलास shards को हटाने, ऊपर mesophase भर से coverglass उठाने, खुर्दबीन पर ध्रुवीकरण सुविधा का उपयोग करने के लिए क्रिस्टल देखते हैं और उन्हें कटाई के दौरान ट्रैक, और अंत में mesophases के विभिन्न प्रकार से निपटने और उन से कटाई. mesophase, और जिस आसानी के साथ क्रिस्टल काटा जा सकता है विस्तार, बनावट crystallization दौरान समय के साथ परिवर्तन करता है. यह इसलिए महत्वपूर्ण है कम मूल्यवान क्रिस्टल के साथ लेकिन उन कि अधिक मूल्यवान वाले के रूप में एक ही परिस्थितियों में हो गए हैं के साथ कटाई अभ्यास. यह संभव है meso या lipidic घन चरण ²⁸ विधि में लाइसोजाइम और thaumatin के क्रिस्टल विकसित और इन माना किया जाना चाहिएसामग्री और विधि के साथ परिचित पाने के रास्ते से जुटी है. एक भी 1 प्रोटीन से मुक्त mesophase के साथ काम करने के लिए अपने अनियमितता के जानने पर विचार करना चाहिए.

यहाँ का प्रदर्शन प्रक्रियाओं के सभी एक आरामदायक 20 डिग्री सेल्सियस पर या आस किया गया. यह संभव है meso विधि में कम तापमान पर क्रिस्टल विकसित. इस प्रकार, एक metastable राज्य चरण में मेजबानी लिपिड के रूप monoolein 4 डिग्री सेल्सियस ^1,2,29,30 पर इस्तेमाल किया जा सकता है. एक विकल्प के कम तापमान ³¹ crystallization के लिए तर्क से करने के लिए डिज़ाइन पत्रिका 7.9 का उपयोग करने के लिए है. हम कम तापमान crysallogenesis नियमित कुछ झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य के साथ. इस मामले में, क्रिस्टल विकास और कटाई चलने में 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में किया जाता है. ऐसी परिस्थितियों में कार्य करना अपनी चुनौतियों का सामना है जो नहीं की कम से कम गर्म और आरामदायक पोशाक के लिए जरूरत है.

संरचना निर्धारण की समग्र प्रक्रिया में अगले कदम macromolecular crys का उपयोगtallography काटा और तस्वीर ठंडा के रूप में इस लेख में प्रदर्शन पर क्रिस्टल विवर्तन डेटा इकट्ठा meso-विकसित क्रिस्टल आम तौर पर छोटे. हालांकि, उपयोगी विवर्तन डेटा संग्रह 20 ⁹ सुक्ष्ममापी की एक अधिकतम आयाम होने क्रिस्टल के साथ संभव है. इस प्रयोजन के लिए, सूक्ष्म किरण सिंक्रोटॉन एक्स – विकिरण का इस्तेमाल किया जाता है और इस श्रृंखला में ^32,33 एक अलग जौव लेख का ध्यान केंद्रित है.

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Components
Curved tweezers	Sigma	F4142	Tool
Disposable pipette tips	Gilson	Various	Disposable
Foam dewar	Spearlab	FD-500	Tool
Glass and metal waste containers	Daniels Healthcare	DD479OL	Tool
Harvesting loops	MiTeGen	Various	Tool
Harvesting microscope	Nikon	SMZ1500	Tool
Lab notebook	Various	NA	Tool
Magnetic push button sample loading wand	Hampton Research/Molecular Dimensions	HR4-729/MD7-411	Tool
Original Puck (for use with ALS-style robots only)	Crystal Positioning Systems	CP-111-035	Tool
Pipetting devices	Gilson	Various	Tool
Precipitant solutions	Various	Various	Reagent
Puck Bent Cryo-Tong	Crystal Positioning Systems	CP-111-030	Tool
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod	Crystal Positioning Systems	CP-111-029	Tool
Purified water	Millipore		Reagent
Safety goggles	Various	NA	Tool
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper)	Crystal Positioning Systems	CP-111-015	Tool
Shipping dewar	Taylor-wharton	CX100	Tool
Tissues	NA	NA	Disposable
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber)	Silverline Tools (Yeovil, UK)	633657	Tool