형광<em> 현장에서</em> 하이브리드화 (물고기) 메소드는 시각적으로 형광 현미경을 사용하여 바이러스 게놈 RNA를 탐지하기 위해 개발되었습니다. 프로브가 다음 하이브 리다이 제이션 및 immunofluorescence 기법의 조합을 사용하여 확인할 수있는 바이러스 RNA의 특이성으로 이루어집니다. 이 기술은 세포 내 바이러스 인신 매매 사건의 컨트롤에 정보를 제공, 정상 상태에서 바이러스 RNA 또는 DNA의 지방화를 식별하는 장점을 제공합니다.
세포가 바이러스 복제에 에너지와 자원을 유용하기 위해 사용될 정상적인 세포 기능에 구체적인 변화를 이끌어내는 감염 바이러스. 숙주 세포 기능의 여러 측면은 일반적으로 바이러스성 유전자 제품의 표현으로, 바이러스에 의해 징발되어 채용 숙주 세포 단백질과 기계니다. 또한, 모바일 vesicles 및 모터 단백질에 대한 바이러스 엔지니어 구체적인 멤브레인 organelles 또는 태그가 셀 (드 노보 감염시 바이러스가 공동 제외 분자 모터 단백질 핵을 타겟의 지역을 타겟팅하는 데, 나중에, 바이러스 조립하는 동안, 그들은 세포 공중 납치됩니다 ) 바이러스의 조립에 도움이 될 것입니다 기계. 이하는 바이러스가 특히 RNA의 genomes있는 사람은 단백질과 RNA 구성 요소 모두의 세포내 밀매를 조정하고 그들이 세포의 특정 loci에서 전염성 입자의 조립을 달성하는 방법 방법에 대한 이해된다. RNA의 지방화의 연구는 이전 일을 시작했다. 낮은 진핵세포의 그들을 개발bryos와의 연결 세포가 중요한 생물 학적 정보를 제공하고, 또한 유전자 표현 폭포의 프로그래밍에서 RNA의 지방화의 중요성을 강조. 다른 생물과 세포 시스템의 연구는 유사한 중요한 정보를 굴복했다. 바이러스는 고맙게 여기게 기생충하고 복제하기 위해 호스트 세포를 활용해야합니다. 따라서 그것은 RNA 바이러스가 자손 바이러스 입자 하나에 세포질을 통해 대한 최종 목적지 중 하나와 핵 기공을 통해 핵,,,에서 자신의 RNA의 genomes 직접 방법을 이해하는 것이 중요합니다.
물고기는 바이러스 RNA의 정상 상태 지방화의 변화를 식별할 수있는 유용한 도구 역할을한다. 공동 분석은 바이러스성 RNA 3 단백질의 공동 지방화에 대한 정보를 제공할 경우 immunofluorescence (IF) 분석 22 물고기 / 결합합니다. 이 분석은 따라서 다른 생화 학적 또는 biophysical에 의해 RNA-단백질 상호 작용에 대해 테스트하는 좋은 시작 지점을 제공합니다자체적으로 공동 지방화 이후로 4,5 테스트, 상호 작용의 일부가 될 수있는 충분한 증거가되지 않습니다. 이와 같은 방법을 사용하여 바이러스 RNA의 지방화를 연구에서는 풍부한 정보는 바이러스와 세포의 RNA 밀매 이벤트 6 모두에서 얻고있다. 예를 들어, HIV-1 감염 세포의 핵에서 RNA를 생산하지만, RNA는 세포질로 번역된다. 키가 바이러스성 단백질이 없거나 (레브) 7, 바이러스 RNA의 물고기는 바이러스 복제에 블록이 핵 8 HIV-1 게놈 RNA의 기억력 덕분임을 밝혔다.
여기서는 원래의 장소에 바이러스 게놈 RNA의 시각적 분석 방법을 제시. 방법은 라벨이 RNA 프로브 이용한다. 이 프로브는 바이러스 게놈의 RNA에 대한 보완이 될 수 있도록 설계되었습니다. 동안 안티 센스 RNA 프로브, digoxigenin (잘해봐)로 수정됩니다 ribonucleotide의 체외 합성의가 체외 transcr에 포함되어 있습니다iption 반응. 탐사선이 세포의 표적 mRNA에 hybridized되면 물고기 / IF를 수행할 때, 후속 항체 라벨 단계 (그림 1)은 mRNA의 국산화뿐만 아니라 관심있는 단백질을 보여줄 것입니다.
물고기 / 공동 분석 IF 지금 9,15,16를 수정되어 세포에 바이러스 RNA를 시각화하는 안정적인 방법입니다. 수년에 걸쳐, 우리는 RNA에 대한 더럽히는 것의 세련된 방법을 개발했습니다. 이 기술은 프로브가 대상 RNA 17에만 제공되는 세포 유형의 다양한 배열에 사용할 수 있습니다. 쫄지마로 프로브를 레이블링함으로써 우리는 단순 염색법에 의해 RNA를 시각화 할 수 있습니다. RNA와 다른 단백질에 대한 더럽히는 것이 결합되면, 생선 / IF 공동 분석은 세포 구조와 단백질 / RNA 지방화를 관찰하는 강력한 도구가됩니다.
RNA 검출의 특이성은 아주 높습니다. 이것은 그림 2에 설명된됩니다. 레브의 부족이 핵 18에서 바이러스 RNA를 갇힌 것을 설립 바이러스성 게놈 RNA의 현지화, 생선에 초점을 맞춘 독창적인 작품의 일부입니다. 이 때문에, 바이러스성 게놈 RNA의 지방화에 대한 풍부한 새로운 정보 techniqu를 사용하여 얻은되었습니다전자 여기서 설명했다. overexpressing 세포 단백질함으로써, 특정 집단 – 아닌 바이러스성 RNA 모두의는 세포의 여러 지역에 집중하기 위해 강제로 할 수 있습니다. hnRNP A2가에서 siRNA에 의해 소진되면 표현형 유사한 RILP의 overexpression은 얻은 HIV-1-표현, 세포에게 열세 것은 RNA가 가시 MTOC에 축적됩니다. (세포 주변에 세포내 도메인에서 바이러스 게놈 RNA의 릴리스 dynein 중쇄 1 결과 중 p50/Dynamitin overexpression 또는 최저 : 바이러스성 게놈의 RNA는 마이너스 엔드 모터 단백질, dynein을 해제하여 셀 주변에 직면 수 그림 2). 그들은 더 이상 적극적으로 juxtanuclear 도메인에서 현지되기 때문에 더 이상 dynein 모터를 바인딩하지 RILP, RILPΔN의 돌연변이, 분광는 세포질에 (LAMP1로 태그가) endosomes. 이러한 결과는 HIV-1의 게놈 RNA의 특히 플라스틱 인구의 개념을 가리키는 HIV-1 게놈의 여러 수영장바이러스성 복제주기의 때때로 식별 역할과 존재를 알 엔. 이 같은 개념은 이미이 mRNA, 개그 19으로 인코딩된 단백질에 대한 확인되었습니다.
물고기 / 항체의 선택과 예약에 관련된 공동 분석 IF의 용도에 한계가 있습니다. 기본 및 보조 항체, 그들의 농도, 최고의 조합 최적화 (표 1 & 2 참조) 최적화하기 위해 시간이 소요됩니다. 주요 기업 hybridomas 만든이나 생산된 항체가 1시 2분에서 1:2000으로 어디서나 다양하지만, 최상의 결과를 위해 제조 업체에서 제공한 지침에 따라 반드시 농도를 가질 수 있습니다. 항체가 생산되는 호스트도 고려 하에서 촬영되어야합니다. 염소 항체와 혼합 양 또한 교차 종 인식 (데이터가 표시되지 않음)에 의한 높은 배경이 조합 결과로 기본 및 보조 항체에 피해야한다. 알렉사 – 형석 seconda위한공예의 항체는 농도가 집합의 거의 모든 항체에 대해 1:500에서 사용할 수 있습니다. 이 보고서에 설명된대로 물고기 / 공동 분석한다면 다른 단점은 세포를 고정하고 paraformaldehyde와 세제 (그림 1)를 사용 permeabilized 후에 그것, 정상 상태에서 해당 위치에서 RNA를 캡처합니다.
그러나, 살아있는 세포에서 RNA 이미징은 주로 같은 GFP와 같은 형광 단백질에 의해 태그 바이러스성 RNA의 genomes의 변형을 사용하여 수단 20-22의 다양한 통해 달성되었습니다. 그러나 살아있는 세포에서 RNA의 지방화를 식별하기위한 추가적인 수단이 표면으로 진행합니다. 이 새로운 방법은 시금치 23, SNAP 24 수단, 또는 MTRIP 2로 태그 RNA를 포함. 이러한 기법은 또한 잔기가 현미경에 의해 mRNA를 검출 위해 mRNA에 태그를 추가할 수 있도록 설계되어야 기판을 추가하거나 이전에 세포를 permeabilize하는 요건을 포함하여 몇 가지 단점으로 고생. 실제로 주요 adva이 보고서에 제시된 생선 분석의 ntage는 원시 RNA가 가장 생리학 관련성이 높은 결과로 이어지는 변형이라는 사실에있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 방법론의 발전에 공헌을위한 실험실의 과거와 현재 회원이 조언은 여기와 앨런 Cochrane에 대한 설명 감사합니다. 라는 프레 이저, Monat 및 MacPherson 경력 상가 지원하는 보건 연구 (CIHR) 박사 원정과 AJM의 캐나다 연구소의 수신자입니다. 이 작품은 CIHR (교부금 # 걸레-56974)에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.