Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor
Summary
Biz nöron veya polietilen emme pipet kullanarak herhangi bir nöronal yoluna floresan ve kalsiyum duyarlı boyalar yüksek konsantrasyon tanıtmak için basit ve düşük maliyetli tekniği tanımlandı.
Abstract
Nöronların Retrograd etiketleme de nöronlar 3-6, kalsiyum ve voltaj duyarlı boyalar yüklemek için kullanılan bir standart anatomik yöntemi 1,2. Genel olarak, boyalar katı kristaller halinde ya da cam pipet kullanılarak lokal baskısı enjeksiyon yoluyla uygulanır. Bununla birlikte, bu birkaç saat boya difüzyonu için gerekli olan, özellikle boya ve azaltılmış etiketleme yoğunluğunun seyreltme ile sonuçlanabilir. Burada boya çözeltisi ile doldurulmuş bir polietilen emiş pipet kullanılarak nöronlar içine flüoresan ve iyon karşı hassas boyaların sokulması için basit ve düşük maliyetli bir teknikle göstermektedir. Bu yöntem, yükleme işlemi boyunca akson ile temas halinde boya yüksek bir konsantrasyonunun muhafaza için güvenilir bir yol sunar.
Protocol
Floresan dekstranlar anatomik araçları olarak ve görüntüleme nöronal aktivitenin 1-4 için kullanılmıştır. Alanlar ve ark., (2009) 4 model sistem olarak omurilik odaklanarak aksonal yolları için iyon ve voltaj duyarlı boya uygulamak için bir protokol yayınlamıştır. Burada in-vitro optophysiological ve morfolojik çalışmalar için kesim ventral kök, dorsal kök ve omuriliğin herhangi bir nöronal yollarını floresan ve / veya iyon duyarlı boya uygulamak içi…
Discussion
<p class="jove_content"> Biz burada nöronlar, sinirler ve spinal yolları içine boyalar tanıtılması için basit ve düşük maliyetli bir protokolü tanımlar. Bu yöntem, yükleme işlemi süresi için bir yüksek oranda konsantre boya çözeltisine tanımlanan anatomik yollar açığa içerir. Biraz arka plan bilgisi ile hedef sitenin retrograd etiketleme Bu sonuçlar microinjections, banyo uygulama ve elektroporasyon tekniklere nazaran. Bununla birlikte, bu yöntem, bir akson izole edilebilir yollarının sinir sisteminde siteleri il…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüleri ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Strok intramural programı tarafından desteklenmiştir. Ayrıca yöntem ve Şekil 3'te verilere daha önceki katkıları için Dr George Mentis teşekkür etmek istiyorum.</p>
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments | |
| Tubing | PE90 (IDxOD:0.034″x0.050″; Wall Thikness:0.008″) | Clay Adams Brand Intermedic | 427421 | For Type I & Type II pipettes |
| NSF-51(IDxOD:1/16×1/8; Wall Thikness:1/32) | PharMed BPT, Cole-Parmer | AY242002 | For Flexible tubing | |
| Syringe | 1ml insulin Syringe U-100 | Becton Dickenson | 329650 | |
| Needle | 19G x1-1/2″ Metal Hub Needle | MONOJECT | 200136 | Connecting Type II pipette to syringe |
| Alcohol Lamp | ||||
| Stopcock | Three-way Stopcock with Male Luer Slip Adapter | Baxter Healthcare Corp. | 2C6241 | Use with syringe |
| Holder | H-1 electrode holder | Narishige | H-1/12 | |
| Magnet stand | Narishige | GJ-8 | ||
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | ||
| Tweezers | S&T DUMONT Swiss 00632-11 | DUMONT | JF-5 TC | |
*Those are suggested materials. Can be replaced with any compatible products
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O’Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O’Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
- O’Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O’Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O’Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O’Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O’Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
Citer Cet Article
Blivis, D., O’Donovan, M. J. Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (62), e4008, doi:10.3791/4008 (2012).