Immobilisation planaire, l'irradiation partielle, et la transplantation de tissus
Summary
Une méthode efficace pour le greffage des tissus de taille définie et cohérente entre les planaires est décrite. On y trouve aussi une description de la façon dont la technique d'immobilisation utilisée pour la transplantation peut être adapté, en collaboration avec des boucliers de plomb, pour l'irradiation partielle d'animaux vivants.
Abstract
La planaire, un ver plat d'eau douce, s'est révélée être un puissant système pour disséquer la régénération des métazoaires et 1,2 biologie des cellules souches. La régénération des tissus planaire de toute manquants ou endommagés est rendu possible par les cellules souches adultes appelé néoblastes 3. Bien que ces cellules souches ont été définitivement démontré d'être pluripotentes et singulièrement capable de reconstituer un animal entier 4, l'hétérogénéité au sein de la population de cellules souches et de la dynamique de leurs comportements cellulaires restent largement non résolues. En raison du grand nombre et une large diffusion des cellules souches dans le plan du corps planaire, des méthodes avancées de manipulation de sous-populations de cellules souches pour l'étude moléculaire et fonctionnelle in vivo sont nécessaires.
La transplantation de tissus et de l'irradiation partielle sont deux méthodes par lesquelles une sous-population de cellules souches planaires peuvent être isolés pour une étude plus approfondie. Chaque technique présente des avantages distincts. Tla transplantation question permet de l'introduction de cellules souches, dans un hôte naïf, qui sont soit intrinsèquement génétiquement distincte ou qui ont été préalablement traités pharmacologiquement. En variante, l'irradiation partielle permet l'isolement de cellules souches dans un hôte, juxtaposés à un tissu dépourvu de cellules souches, sans l'introduction d'une plaie ou d'une culasse en intégrité des tissus. L'utilisation de ces deux méthodes, on peut étudier les facteurs cellulaires autonomes et non autonomes que les fonctions de contrôle sur les cellules souches, comme la prolifération, la différenciation et la migration.
Les deux tissus de transplantation 5,6 et partielle d'irradiation 7 ont été utilisés historiquement dans la définition de la plupart des questions au sujet de la régénération planaire qui restent à l'étude aujourd'hui. Cependant, ces techniques sont restés sous-utilisés en raison de la nature laborieuse et incohérente des méthodes précédentes. Les protocoles présentés ici représentent un grand pas en avant dans la réduction du temps unee les efforts nécessaires pour générer de manière reproductible un grand nombre d'animaux greffés ou partiellement irradié avec des efficacités de près de 100 pour cent. Nous couvrons la culture des grands animaux, l'immobilisation, la préparation pour l'irradiation partielle, la transplantation de tissus, et l'optimisation de la récupération des animaux. En outre, le travail décrit ici démontre la première application de la méthode par irradiation partielle pour une utilisation avec la planaire le plus largement étudié, Schmidtea mediterranea. En outre, le tissu efficace de greffage dans planaria ouvre la porte pour le test fonctionnel des sous-populations de cellules souches naïfs ou traités dans des essais de repeuplement, qui a longtemps été la méthode étalon-or de dosage adulte potentiel des cellules souches chez les mammifères 8. Une large adoption de ces techniques sera sans aucun doute à une meilleure compréhension des comportements cellulaires de cellules souches adultes au cours de l'homéostasie tissulaire et la régénération.
Protocol
Discussion
Importance de l'immobilisation
Immobilisation est de loin l'étape la plus critique pour la réussite de chacun de ces processus. Si planaria sont mal immobilisé avant l'irradiation partielle, ils peuvent se déplacer sous le blindage de plomb, produisant des résultats incohérents et la confusion. En outre, si les animaux ne sont pas suffisamment immobilisé après la transplantation, le ver hôte sera probablement s'éloigner de la greffe de tissu, résultant en un échec de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Chiyoko Kobayashi et Kiyokazu Agata pour obtenir des conseils utiles sur la transplantation planaire ainsi que les membres passés et présents du laboratoire Sánchez pour les discussions précieuses lors de l'élaboration de ces techniques. Ce travail a été soutenu par le NIH Grant formation (5T32 HD0791) à BCG et les NIH R37GM057260 à l'AAS. ASA est un Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 |
| Black filter paper | Schleicher & Schuell | 10310809 |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H. The regeneration of the tail in lumbriculus. J. Morphol. 7, 317-344 .
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F. Studies on transplantation in planaria. Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).
- Morgan, L. Regeneration of grafted pieces of planarians. J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).
- Dubois, F. Contribution á l ‘ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
