ב electroporation לג'ימי של המוח התיכון צ'יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין
Summary
כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה המערבת<em> ב לג'ימי</em> Electroporation של מבנים DNA פלסמיד לתוך עובריים הגחון חומוס המוח התיכון אבות נוירונים דופאמין. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להשיג ביטוי יעיל של גנים בעלי עניין לחקור היבטים שונים של התפתחות המוח התיכון והבחנה נוירון דופאמין.
Abstract
נוירונים דופאמינרגיים הנמצאים בתנועה המוח התיכון הגחון שליטה, התנהגות רגשית, מנגנוני תגמול 1-3. תפקוד לקוי של המוח התיכון הגחון דופאמין נוירונים הוא מעורב מחלת פרקינסון, סכיזופרניה, דיכאון, דמנציה 1-5. לכן, לימוד ויסות התמיינות המוח התיכון דופאמין נוירון לא רק מספקים תובנה חשובה לתוך מנגנוני ויסות התפתחות המוח התיכון ואת המפרט עצבית גורל אבי, אלא גם לעזור לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול במגוון הפרעות עצביות אדם.
נוירונים דופאמינרגיים להבדיל בין אבות עצביים המצפים את אזור החדר של המוח התיכון הגחון העוברית. הפיתוח של אבות עצביים נשלטת על ידי תוכניות ביטוי גנים 6,7. כאן אנו מדווחים על ניצול טכניקות electroporation לבטא גנים בפרט המוח התיכון הבמה המילטון (HH) המבורגר 11 (הsomites irteen, 42 שעות) ועוברים חומוס 8,9. פיתוח חיצוני של עוברים חומוס מאפשר מניפולציות ניסיוניים נוחים בשלבים עובריים ספציפיים, עם השפעות שנקבעו בנקודות זמן ההתפתחות לאחר מכן 10-13. חומוס צינורות עובריים עצביים מוקדמים יותר בשלב HH 13 (תשע עשרה somites, 48 שעות) מורכב אבות עצביים multipotent המסוגלים להבדיל את סוגי תאים שונים של מערכת העצבים. וקטור pCAG, המכיל גם מקדם CMV ו חומוס β-אקטין משפר, מאפשר ביטוי חזק של דגל או בונה epitope-מתוייגים אחרים צינורות חומוס עובריים עצביים 14. בדו"ח זה, אנו מדגישים באמצעים מיוחדים על מנת להשיג ביטוי גנים מוגבל לאזור של המוח התיכון עובריים אבות דופאמין נוירונים, כולל כמה להזריק DNA בונה במיוחד לאזור המוח התיכון עובריים וכיצד לאתר electroporation עם מחוייט אלקטרודות קטנות. ניתוח גהמוח התיכון כפרי בשלבים מאוחרים יותר מספק מצוין במערכת vivo עבור וקטור פלסמיד בתיווך רווח פונקציה של ואובדן-of-פונקציה מחקרים של התפתחות המוח התיכון. שינוי של מערכת הניסוי רשאי להאריך את assay לחלקים אחרים של מערכת העצבים לביצוע מיפוי וניתוח גורל לחקירת ויסות של ביטוי גנים.
Protocol
Discussion
ב electroporation לג'ימי של המוח התיכון חומוס עובריים מציע עלות נמוכה אלטרנטיבה מהירה לדור של בעלי חיים מהונדס או בנוקאאוט לבצע מחקר vivo של פונקציות גנים בהתפתחות המוח התיכון דופאמין נוירון. שימוש מ"מ קצר 2 אלקטרודות פלטינה ארוכים בצורת יחד עם הזרקת ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר Takahiko מאטסודה למתן pCAG-mCherry לבנות. YCM נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה מטעם קרן Schweppe ומענק מקרן וייטהול.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
