I ovo electroporation i Chick midbrain for å studere gen-funksjon i dopaminerg Neuron Development
Summary
For å vurdere funksjon og regulering av gener under utviklingen av midbrain dopaminerge nevroner, beskriver vi en metode som involverer<em> I ovo</em> Electroporation av plasmid DNA konstruerer inn embryonale chick ventrale midbrain dopaminerge nevroner stamfedre. Denne teknikken kan brukes for å oppnå effektiv uttrykket av gener av interesse å studere ulike sider ved midbrain utvikling og dopaminerge nevroner differensiering.
Abstract
Dopaminerge nevroner lokalisert i ventrale midbrain kontroll bevegelse, emosjonell atferd og belønne mekanismer 1-3. Dysfunksjon i ventral midbrain dopaminerge nevroner er innblandet i Parkinsons sykdom, schizofreni, depresjon, og demens 1-5. Dermed kunne studere reguleringen av midbrain dopaminerge nevroner differensiering ikke bare gi viktig innsikt i mekanismene som regulerer midbrain utvikling og nevrale stamceller skjebne spesifikasjonen, men også bidra til å utvikle nye terapeutiske strategier for behandling av en rekke menneskelige nevrologiske lidelser.
Dopaminerge nevroner skille fra nevrale stamceller langs ventrikulære sonen embryonale ventral midbrain. Utviklingen av nevrale stamceller styres av genuttrykk programmer 6,7. Her rapporterer vi teknikker som utnytter electroporation å uttrykke gener spesifikt i midbrain av Hamburger Hamilton (HH) stadium 11 (thirteen somites, 42 timer) kyllingembryo 8,9. Den eksterne utviklingen av kyllingembryo gir praktiske eksperimentelle manipulasjoner på bestemte embryonale stadier, med de effektene som fastlegges ved senere utviklingsmessige tidspunkter 10-13. Chick embryonale nevrale rør tidligere enn HH stadium 13 (nitten somites, 48 timer) består av multipotent nevrale stamceller som er i stand til å differensiere til forskjellige celletyper i nervesystemet. Den pCAG vektor, som inneholder både en CMV promoter og en kylling β-actin enhancer, åpner for robust uttrykk av flagg eller andre epitop-merket konstruksjoner i embryonale chick nevrale rør 14. I denne rapporten legger vi vekt på spesielle tiltak for å oppnå regionalt begrenset genuttrykk i embryonale midbrain dopaminerge nevroner stamfedre, inkludert hvordan du injiserer DNA konstruerer spesifikt inn på embryonale midbrain regionen og hvordan finne electroporation med små skreddersydde elektroder. Analysere cHick midbrain på senere stadier gir en utmerket in vivo system for plasmid vektor-mediert gain-of-funksjon og tap-av-funksjon studier av midbrain utvikling. Endring av den eksperimentelle systemet kan utvide analysen til andre deler av nervesystemet for å utføre skjebne kartlegging analyse og for å undersøke regulering av genuttrykk.
Protocol
Discussion
Den i ovo electroporation av embryonale dama midbrain tilbyr en lav pris og rask alternativ til generering av transgene eller knockout dyr til å utføre in vivo studier av gen-funksjoner i midbrain dopaminerge nevroner utvikling. Bruke kort 2 mm lange L-formet platina elektroder sammen med embryonale midbrain-spesifikk DNA injeksjon er nøkkelen for å oppnå effektiv uttrykk av genet av interesse i midbrain dopaminerge nevroner stamfedre. I tillegg bruker riktige HH sceniske 11 kyllingembryo er kriti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Takahiko Matsuda for å gi pCAG-mCherry konstruere. YCM støttes av en Career Development Award fra Schweppe Foundation og en bevilgning fra Whitehall Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
