Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em> In vitro</em> Pour identifier les sites de pause de translation le long d'ARNm
Summary
Une technique pour identifier les sites de pause translationnelle sur l'ARNm est décrite. Cette procédure est basée sur l'isolement des polypeptides naissants qui s'accumulent sur les ribosomes lors de la traduction in vitro d'un ARNm cible, suivie par l'analyse de la taille des chaînes naissantes en utilisant une électrophorèse sur gel dénaturant.
Abstract
Le taux d'allongement de translation n'est pas uniforme. ARNm structure secondaire, l'usage des codons et ARNm des protéines associées peuvent modifier le mouvement du ribosome sur le message pour revue, voir 1. Cependant, il est maintenant largement admis que l'usage des codons synonymes est la principale cause de non-uniformes des taux d'allongement de translation 1. Codons synonymes ne sont pas utilisés avec une fréquence identique. Un biais existe dans l'utilisation des codons synonymes avec certains codons utilisés plus fréquemment que d'autres 2. Codon biais est l'organisme ainsi que le tissu spécifique 2,3. En outre, la fréquence de l'usage des codons est directement proportionnelle à la concentration des ARNt apparenté 4. Ainsi, un codon fréquemment utilisé aura plus multitude de ARNt correspondants, ce qui implique en outre que d'un codon fréquentes seront traduits plus rapidement qu'une rares. Ainsi, les régions sur l'ARNm enrichi en codons rares (sites de pause potentiels) seront, en règle ralentir le mouvement du ribosome sur le message d'accumulation et de la cause des peptides naissants des tailles respectives 5-8. Ces sites de pause peut avoir un impact fonctionnel sur l'expression des protéines, stabilité de l'ARNm et le repliement des protéines pour revue, voir 9. En effet, il a été montré que l'atténuation de ces sites de pause peut altérer le mouvement du ribosome sur l'ARNm et par la suite peut affecter l'efficacité du co-traductionnelle repliement des protéines (in vivo) 1,7,10,11. Pour comprendre le processus de repliement des protéines in vivo, dans la cellule, qui est finalement couplé au processus de synthèse des protéines, il est essentiel d'obtenir un aperçu complet sur l'impact du codon d'utilisation / ARNt contenu sur le mouvement des ribosomes le long de l'ARNm en cours d'élongation translationnelle .
Nous décrivons ici une technique simple qui peut être utilisé pour localiser les principaux sites de pause de traduction pour un ARNm donné traduit en diverses des systèmes acellulaires 6-8. Cette procédure est basée sur l'isolement des polypeptides naissante accumulating sur les ribosomes lors de la traduction in vitro d'un ARNm cible. La logique est celle à basse fréquence des codons, l'augmentation du temps de séjour des résultats ribosomes dans des quantités accrues de peptides naissants des tailles correspondantes. Dans ARNm transcrit in vitro est utilisé pour des réactions de translation in vitro de la présence d'acides aminés marqués radioactivement pour permettre la détection des chaînes naissantes. Afin d'isoler les ribosomes liés naissantes complexes polypeptidiques la réaction de traduction est posée sur le dessus de la solution de glycérol à 30% suivie d'une centrifugation. Polypeptides naissants dans polysomique granulés sont traités avec la ribonucléase A et résolus par SDS-PAGE. Cette technique peut être éventuellement utilisées pour une protéine et permet l'analyse de mouvement le long du ribosome ARNm et la détection des sites de pause principaux. En outre, ce protocole peut être adapté pour étudier les facteurs et conditions qui peuvent altérer le mouvement du ribosome et donc potentiellement peut également modifier ee fonction / conformation de la protéine.
Protocol
Discussion
Pour obtenir des résultats reproductibles, la qualité et la concentration des composants utilisés pour la transcription in vitro et les réactions de traduction sont essentielles. Dans l'étude actuelle, nous avons utilisé des kits disponibles dans le commerce et les extraits qui fournissent des données hautement reproductibles, s'il est manipulé avec soin. Cependant, la traduction-compétentes extraits peuvent être préparés à partir de la cellule de son choix, si nécessaire. Qualit?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par Human Frontier Science Program de subvention RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
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