Produktion av Lentiviral vektorer för att omvandla Celler från det centrala nervsystemet
Summary
I detta protokoll beskriver vi produktion, rening och titrering av lentivirala vektorer. Vi erbjuder ett exempel på lentivirusvektor-medierad gen leverans i primära odlade nervceller och astrocyter. Våra metoder kan också tillämpas på andra celltyper<em> In vitro</em> Och<em> In vivo</em>.
Abstract
Effektiv gen leverans i centrala nervsystemet (CNS) är viktigt att studera genfunktioner, modellering neurologiska sjukdomar och utveckla terapeutiska metoder. Lentivirala vektorer är attraktiva verktyg i transduktion av nervceller och andra celltyper i CNS, eftersom de transducera både delande och icke-delande celler, stödja hållbar uttryck av transgener, och har relativt stora förpackningar kapacitet och låg toxicitet 1-3. Lentivirala vektorer har använts med framgång i transduktion av många neurala celltyper in vitro 4-6 och i djur 7-10.
Stora ansträngningar har gjorts för att utveckla lentivirala vektorer med förbättrad biologisk säkerhet och effektivitet för genavgivning. De nuvarande tredje generationens replikationsdefekta och själv-inaktiverande (SIN) lentivirala vektorer visas i figur 1. De nödvändiga elementen för vektor förpackningar är uppdelade i fyra plasmider. I lentivirala tränsFER-plasmiden, är U3-regionen i 5 'långa terminala upprepningen (LTR) ersattes med en stark promotor från ett annat virus. Denna modifiering tillåter transkription av vektorsekvensen oberoende av HIV-1 Tat-protein som normalt krävs för HIV-genexpression 11. Packningssignalen (Ψ) är väsentlig för inkapsidering och den rev-responsiva elementet (RRE) krävs för att producera höga titrar vektorer. Den centrala tarmkanalen polypurin (cPPT) är viktigt för nukleära importen av vektorns DNA, en egenskap som krävs för att omvandla icke-delande celler 12. I 3 'LTR, är de cis-regulatoriska sekvenser fullständigt avlägsnas från U3-regionen. Denna deletion kopieras till 5 'LTR efter omvänd transkription, vilket resulterar i transkriptionell inaktivering av båda LTR. Plasmiden pMDLg / pRRE innehåller HIV-1 gag / pol-gener, vilka ger strukturella proteiner och omvänt transkriptas. pRSV-Rev kodar för rev, som binder till RRE för effektiv RNA-export från kärnan. pCMV-G kodardet vesikulära stomatitvirus glykoprotein (VSV-G) som ersätter HIV-1 env. VSV-G utökar tropism av vektorerna och tillåter koncentration via ultracentrifugering 13. Alla gener som kodar för de accessoriska proteiner, inklusive Vif, Vpr, Vpu, och Nef är uteslutna i förpackningssystemet. Framställning och manipulering av lentivirala vektorer bör utföras enligt NIH riktlinjer för forskning involverar rekombinant DNA ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). Ett godkännande från enskilda institutionella Biologisk och kemisk säkerhet kommittén kan krävas innan lentivirala vektorer. Lentivirala vektorer framställs vanligen genom samtransfektion av 293T-celler med lentivirala överföring plasmiden och de plasmider hjälpar som kodar för de proteiner som krävs för vektorn förpackning. Många lentivirala överföring plasmider och plasmider hjälpar kan erhållas från Addgene, en ickeVinstdrivande plasmid arkiv ( http://www.addgene.org/~~V ). Några stabila förpackningar cellinjer har utvecklats, men dessa system ger mindre flexibilitet och deras förpackningar verkningsgrad generellt minskar över tid 14, 15. Kommersiellt tillgängliga transfektion kit kan stödja hög effektivitet i transfektion 16, men de kan bli mycket dyrt för stora förberedelser skala vektor. Kalciumfosfatfällning metoder ger mycket effektiv transfektion av 293T-celler och därmed ge en tillförlitlig och kostnadseffektiv metod för lentivirusvektor produktion.
I detta protokoll, producerar vi lentivirala vektorer genom samtransfektion av 293T-celler med fyra plasmider baserade på kalciumfosfatutfällningsmetoden princip, följt av rening och koncentration med ultracentrifugering genom en 20% sackaros kudde. Vektor titrar bestämdes genom fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) analysis eller genom realtid qPCR. Produktion och titrering av lentivirala vektorer i detta protokoll kan vara klar med 9 dagar. Vi tillhandahåller ett exempel av transducerande dessa vektorer in i murina hjärnbarkens kulturer innehållande både neuroner och astrocyter. Vi visar att lentivirala vektorer stödja höga effektivitet transduktion och celltyp-specifik genexpression i primära odlade celler från centrala nervsystemet.
Protocol
Discussion
I detta protokoll, har vi visat produktion av lentivirala vektorer och tillämpningen av dessa vektorer i hjärnbarkens kulturer. Vi visat effektiv och celltyp-specifik transduktion med vektorerna som framställts med dessa metoder. När synapsin promotor används, är uttryck av GFP strikt neuronspecifika. När GFAP-promotor används, är GFP-uttryck uteslutande i astrocyter. Om ingen celltyp-specifik expression önskas, kan en allestädes närvarande promotor användas. Vi funnit ubiqutin och fosfoglyceratkinas (PGK) …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH Neuroscience Blueprint Kärna bidrag (P30 NS057105, BJS) till Washington University, programprojekt Grant NS032636 (BJS) och av Hope Center för neurologiska sjukdomar.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 |
| 1 x 3 ½ in polyallomoer centrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
References
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
- Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
- Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
- Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
- Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
- Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
- Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
- Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
- Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
- Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
- Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
- Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
- Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
- Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
- Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
- Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
- Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).
