Isolering af Humane navlevene-endotelceller og deres anvendelse i undersøgelsen af neutrofil transmigration Under strømningsforhold
Summary
I denne artikel beskrives først en procedure til isolering af humane endotelceller fra navlestrengen vener og derefter viser, hvordan man bruger disse celler til at undersøge neutrofil transmigration under strømningsforhold. Ved anvendelse af en lav-volumen strømningskammeret fremstillet af en polymer med de optiske egenskaber af glas, er levende celle fluorescerende afbildning af sjældne cellepopulationer også mulige.
Abstract
Neutrofiler er de mest udbredte form af hvide blodlegemer. De udgør en væsentlig del af det medfødte immunsystem 1. Under akut inflammation, er neutrofile de første inflammatoriske celler at migrere til stedet for skaden. Rekruttering af neutrofiler til en skade site er en trinvis proces, der omfatter først, udvidelse af blodkarrene til at øge blodgennemstrømningen, for det andet, mikrovaskulære strukturelle ændringer og flygte af plasmaproteiner fra blodbanen, for det tredje, valsning, adhæsion og transmigration af neutrofil på tværs af endothelium, og den fjerde akkumulering af neutrofiler på læsionsstedet 2,3. En lang række in vivo og de vitro fremgangsmåder er udviklet til at undersøgelsen af disse processer 4. Denne metode fokuserer på neutrofil transmigration tværs af humane endotelceller.
En populær metode til at undersøge de molekylære processer involveret i neutrofil transmigration udnytter menneskelige neutrophils interagerer med primære humane navlevene-endotelceller (HUVEC) 5. Neutrofil isolation er blevet beskrevet visuelt andetsteds 6, og dermed denne artikel vil vise en metode til isolering af HUVEC. Når først isoleret og dyrket til konfluens, endotelceller aktiveres resulterer i opregulering af adhæsionsmolekyler og aktivering molekyler. F.eks. Aktivering af endothelceller med cytokiner såsom TNF-a resulterer i forøget E-selectin og IL-8 ekspression 7 E-selectin medierer opsamling og valsning af neutrofiler og IL-8 medierer aktivering og faste adhæsion af neutrofiler. Efter vedhæftning neutrofile transmigrate. Transmigration kan forekomme paracellularly (gennem endotelceller junctions) eller transcellularly (gennem endotelcelle selv). I de fleste tilfælde forekommer disse interaktioner under strømningsbetingelser fundet i vaskulaturen 7,8.
Den parallelle plader strømningskammeret er en almindeligt anvendt system, mimikrofoner den hydrodynamiske forskydningsspændingerne fundet in vivo og muliggør studiet af neutrofilrekruttering under strømningstilstand in vitro 9,10. Flere selskaber producerer parallelle plade strømningskamre og har hver deres fordele og ulemper. Hvis fluorescerende billeddannelse er nødvendig, glas eller en optisk lignende polymer skal anvendes. Endotelceller ikke vokser godt på glas.
Her udgør en let og hurtig fremgangsmåde til fasekontrast, DIC og fluorescerende afbildning af neutrofil transmigration anvendelse af en lav mængde ibidi kanal glider fremstillet af en polymer, der understøtter den hurtige adhæsion og vækst af humane endotelceller og har optiske egenskaber, der er sammenlignelige glas. I denne fremgangsmåde blev endotelceller dyrket og stimuleret med en ibidi μslide. Neutrofiler blev indført under flowbetingelser og transmigration blev vurderet. Fluorescerende afbildning af knudepunkter aktiveres tidstro bestemmelse af omfanget af paracellulær versustranscellulære sjælevandring.
Protocol
Discussion
Forskere har rutinemæssigt anvendt endotelceller fra forskellige kar til at studere neutrofilrekruttering og sjælevandring. Eksempler omfatter, men er ikke begrænset til, dermale mikrovaskulære endotelceller 12, lever sinusformede endotelceller 13 og endotelceller fra human navlevene 10. Blandt dem HUVEC vundet bred popularitet på grund af deres relativt lette isolering og tilgængelighed. HUVEC er en stærk in vitro modelsystem, som efterligner mange endotelceller pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Pina Colarusso og Live Cell Imaging facilitet for deres hjælp med billedbehandling og image analyse; Ms Lailey for hende teknisk bistand og enhed 51 ved foden Hospital i Calgary, AB for at give mennesker navlestrenge. Dr. KD Patel er en Alberta innoverer: Health Solutions Scientist. Dette arbejde blev støttet af et driftstilskud fra canadiske Institutes for Health Research og udstyr og infrastruktur tilskud fra den canadiske Institut for Innovation og Alberta videnskab og forskning Authority.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
