Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine secrete da cellule umane
Summary
Nel periodo post-genomica umana, la disponibilità di proteine ricombinanti in conformazione nativa è cruciale per la ricerca strutturali, funzionali e terapeutico e lo sviluppo. Qui viene descritto un test e larga scala sistema di espressione proteica in cellule renali embrionali umane 293T che possono essere utilizzati per produrre una varietà di proteine ricombinanti.
Abstract
Ricombinante espressione della proteina in batteri, tipicamente E. coli, è stato la strategia più efficace per l'espressione quantità milligrammo di proteine. Tuttavia, ospiti procariotici spesso non sono appropriati per l'espressione di proteine virali umani, o eucariotica a causa della tossicità della macromolecola estera, le differenze nei macchinari ripiegamento proteico, oppure a causa della mancanza di particolari modifiche co-o post-traduzionale di batteri. Sistemi di espressione basati sul lievito (P. pastoris o S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-insetto infetto (S. frugiperda o T. ni) 3 celle, e privo di cellule in vitro sistemi di traduzione 2,4 sono stati utilizzati con successo per produrre proteine di mammifero. Intuitivamente, la corrispondenza migliore è quella di utilizzare un ospite mammifero a garantire la produzione di proteine ricombinanti che contengono gli opportuni modifiche post-traslazionali. Un certo numero di linee cellulari di mammifero (embrionale umano Kidney (HEK) 293, C V-1 in cellule O rigine trasportano il S V40 larget T-antigene (COS), ovariche di criceto cinese (CHO), e altri) sono stati utilizzati con successo per sovraesprimere quantità milligrammi di un certo numero di proteine umane 5-9. Tuttavia, i vantaggi di utilizzare cellule di mammifero sono spesso contrastate da maggiori costi, necessità di apparecchiature di laboratorio specializzato, rese inferiori, proteine e tempi lunghi per sviluppare linee cellulari stabili di espressione. Aumentare la resa e la produzione di proteine più veloci, mantenendo bassi i costi, sono fattori importanti per molti laboratori accademici e commerciali.
Qui, noi descriviamo un tempo e costi contenuti, in due parti procedura per l'espressione di proteine umane secrete da cellule HEK aderenti 293T. Questo sistema è in grado di produrre quantitativi microgrammi per milligrammo di proteina funzionale per studi strutturali, biofisico e biochimiche. La prima parte, costrutti multiple del gene di interesse sono produrred in parallelo e transitoriamente trasfettate in cellule HEK aderenti 293T in piccola scala. La rilevazione e l'analisi di proteina ricombinante secreto nel mezzo di coltura cellulare viene effettuata mediante analisi western blot utilizzando anticorpi disponibili commercialmente diretti contro un vettore codificato tag proteina purificazione. Successivamente, costrutti adatti per produzione su larga scala di proteine vengono trasfettate transitoriamente usando polietilenimmina (PEI) in 10-strato fabbriche di cellule. Le proteine secrete in litro di volumi di terreno condizionato sono concentrate in quantità gestibili mediante filtrazione a flusso tangenziale, seguita da purificazione da anti-HA cromatografia di affinità. L'utilità di questa piattaforma è provato dalla sua capacità di esprimere quantità di milligrammi di citochine, recettori delle citochine, recettori della superficie cellulare, i fattori intrinseci, di restrizione e glicoproteine virali. Questo metodo è stato utilizzato con successo nella determinazione strutturale dei 5,10 trimeriche glicoproteina ebolavirus.
<p class = "jove_content"> In conclusione, questa piattaforma offre facilità d'uso, velocità e scalabilità massimizzando al contempo la qualità delle proteine e la funzionalità. Inoltre, nessuna attrezzatura aggiuntiva, diversa da una normale incubatore umidificato CO 2, è richiesto. Questa procedura può essere rapidamente esteso a sistemi di maggiore complessità, come co-espressione di complessi proteici, antigeni e anticorpi, la produzione di particelle simili a virus di vaccini, o produzione di adenovirus o lentivirus per la trasduzione di linee cellulari difficili.Protocol
Discussion
Il 10-strato fabbriche di cellule sono una nave efficace per la produzione di quantità di milligrammi di proteina. Uno dei principali vantaggi di utilizzare la fabbrica della cellula rispetto ad altre imbarcazioni tradizionali, quali bottiglie, flaconi a rulli scuotere o filatore boccette, è che non richiedono l'acquisto di eventuali attrezzature di laboratorio supplementare. Uno standard di CO 2 incubatore (circa 6.0 cu. Ft) sarà comodamente ospitare quattro 10-layer fabbriche di cellule (Fig….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da un trattamento di HIV Ontario sovvenzione di funzionamento Research Network (ROG-G645) e la Canadian Institutes of Research Investigator Award Salute New (MSH-113554) per JEL, borse di studio e Università di Toronto per HA, FCA, e JDC. Gli autori desiderano ringraziare Marnie Fusco, Dafna Abelson e il Dott. Erica Ollmann Saphire at The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) per le cellule che forniscono, le ebolavirus vettore di espressione GP e consigli generali.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
