En bekvem og General Expression Platform for produktion af secernerede proteiner fra humane celler
Summary
I den post-humane genom-æraen, er tilgængeligheden af rekombinante proteiner i native konformationer afgørende for strukturel, funktionel og terapeutisk forskning og udvikling. Her beskriver vi en test-og store protein-ekspressionssystem i humane embryoniske nyre 293T-celler, som kan anvendes til fremstilling af en række af rekombinante proteiner.
Abstract
Rekombinant protein ekspression i bakterier, typisk E. coli, har været den mest succesfulde strategi for milligram mængde ekspression af proteiner. Imidlertid prokaryote værter er ofte ikke så egnet til ekspression af humane, virale eller eukaryote proteiner på grund af toksicitet af det fremmede makromolekylet, forskelle i proteinfoldning maskinen eller på grund af manglen på bestemte co-eller post-translationelle modifikationer i bakterier. Ekspressionssystemer baseret på gær (P. pastoris eller S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-inficerede insektceller (S. frugiperda eller T. ni) celler 3, og cellefri translation de vitro systemer 2,4 succes er blevet anvendt til at producerer mammale proteiner. Intuitivt det bedste match er at anvende en mammal vært til at sikre produktionen af rekombinante proteiner, der indeholder de korrekte post-translationelle modifikationer. Et antal pattedyrscellelinier (Human Embryonic børneney (HEK) 293, er C V-1-celler i O rigin bærer S V40 indikativpris T-antigen (COS), kinesisk hamsterovarie (CHO), og andre) er blevet anvendt med succes til at overudtrykke milligram-mængder af en række humane proteiner 5-9. Imidlertid er fordelene ved at bruge pattedyrceller imødegås ofte med højere omkostninger, krav om specialiseret laboratorieudstyr, lavere protein udbytter, og lange gange for at udvikle stabile udtryk cellelinjer. Øget udbytte og producerer proteiner hurtigere, og samtidig holde omkostningerne nede, er vigtige faktorer for mange akademiske og kommercielle laboratorier.
Her beskriver vi en tids-og omkostningseffektiv, todelt fremgangsmåde til ekspression af secernerede humane proteiner fra adhærente HEK 293T-celler. Dette system er i stand til at frembringe mikrogram til milligram-mængder af funktionelt protein for strukturelle, biofysiske og biokemiske undersøgelser. Den første del, multiple konstruktioner af genet af interesse er producered parallelt og forbigående transficeret ind i omliggende HEK-293T celler i lille skala. Påvisning og analyse af rekombinant protein secerneret i cellekulturmediet udføres ved western blot-analyse under anvendelse af kommercielt tilgængelige antistoffer rettet mod en vektor-kodede protein rensnings-taggen. Efterfølgende egnede konstruktioner til proteinproduktion i stor skala produktion transient transficeret med polyethylenimin (PEI) i 10 lag cellefabrikker. Proteiner udskilt i l-volumener af konditioneret medium er koncentreret i håndterbare størrelse ved hjælp af tangentielstrømningsfiltrering, efterfulgt af oprensning af anti-HA-affinitetskromatografi. Anvendeligheden af denne platform påvises ved dets evne til at udtrykke milligram-mængder af cytokiner, cytokin-receptorer, celleoverfladereceptorer, iboende begrænsninger faktorer og virale glycoproteiner. Denne fremgangsmåde blev også med held anvendt i strukturel bestemmelse af de trimere ebolavirus glycoprotein 5,10.
<p cpige = "jove_content"> Som konklusion, denne platform tilbyder brugervenlighed, hastighed og skalerbarhed og samtidig maksimere protein kvalitet og funktionalitet. Desuden kræves der ingen yderligere udstyr, undtagen en standard befugtet CO2-inkubator, der kræves. Denne procedure kan hurtigt udvides til systemer med større kompleksitet, såsom co-ekspression af protein-komplekser, antigener og antistoffer, fremstillingen af viruslignende partikler til vacciner, eller produktion af adenovira eller lentivira til transduktion af vanskelige cellelinier.Protocol
Discussion
De 10-lags cellefabrikker er en effektiv beholder til fremstilling af milligram-mængder af protein. En væsentlig fordel ved at anvende cellefabrikken i forhold til andre traditionelle beholdere, såsom rulleflasker og rystekolber eller spinnerkolber, er, at de ikke kræver køb af yderligere laboratorieudstyr. En standard CO 2 inkubator (ca. 6,0 cu. Ft) vil nemt rumme fire 10-lags cellefabrikker (fig. 2). Desuden kræver disse fartøjer mindre arbejdskrævende og plads end retter, kolber el…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en Ontario hiv-behandling Network Research driftstilskud (ROG-G645) og canadiske Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113.554) til JEL, og University of Toronto stipendier til HA, FCA, og JDC. Forfatterne vil gerne takke Marnie Fusco, Dafna Abelson og Dr. Erica Ollmann Saphire på The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) for at give celler, ebolavirus GP ekspressionsvektoren og generel rådgivning.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
