A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas
Summary
Na era pós-genômica humana, a disponibilidade de proteínas recombinantes em conformações nativas é crucial para a investigação estrutural, funcional e terapêutico e desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um-teste e em grande escala sistema de expressão de proteínas em células humanas embrionárias de rim 293T que podem ser utilizados para produzir uma variedade de proteínas recombinantes.
Abstract
A expressão da proteína recombinante em bactérias, tipicamente E. coli, tem sido a estratégia mais bem sucedido para a expressão quantidade miligrama de proteínas. No entanto, hospedeiros procarióticos não são frequentemente como apropriado para a expressão de humanos, as proteínas virais ou eucarióticos, devido à toxicidade da macromolécula externa, as diferenças de a máquina de dobragem de proteína, ou devido à falta de modificações específicas co ou pós-translacional em bactérias. Os sistemas de expressão baseados em levedura (P. pastoris ou S. cerevisiae) 1,2, baculovírus-infectada de insectos (S. frugiperda ou T. ni), as células 3, e livre de células in vitro tradução sistemas 2,4 foram utilizados com sucesso para produzir proteínas de mamíferos. Intuitivamente, a melhor correspondência é usar um hospedeiro mamífero para assegurar a produção de proteínas recombinantes que contêm as adequadas modificações pós-translacionais. Um certo número de linhas de células de mamíferos (Kid embrionário humanoNey (HEK) 293, C V-1 em células que transportam o O RIGEM S V40 larget antigénio T-(COS), de Ovário de Hamster Chinês (CHO), e outros) têm sido utilizados com sucesso para superexpressar quantidades de miligramas de um número de proteínas humanas 5-9. No entanto, as vantagens da utilização de células de mamíferos são frequentemente contrariada pela custos mais elevados, a exigência de equipamento de laboratório especializado, rendimentos mais baixos de proteína, e os tempos longos para desenvolver linhagens de células estáveis de expressão. Aumento de produtividade e produção de proteínas mais rápido, mantendo os custos baixos, são fatores importantes para muitos laboratórios acadêmicos e comerciais.
Aqui, nós descrevemos um tempo e custo-eficácia, o procedimento de duas partes para a expressão de proteínas secretadas humanos a partir de células aderentes HEK 293T. Este sistema é capaz de produzir quantidades de micrograma miligrama de proteína funcional para estudos estruturais, biofísicas e bioquímicas. A primeira parte, as construções de múltiplas do gene de interesse são produzird em paralelo e transientemente transfectados para células aderentes HEK 293T em pequena escala. A detecção e análise de proteína recombinante segregada no meio de cultura de células é realizada por análise de Western blot utilizando anticorpos comercialmente disponíveis dirigidos contra uma etiqueta de purificação do vector proteína codificada. Subsequentemente, as construções adequadas para produção em larga escala de proteínas são transitoriamente transfectadas utilizando polietilenoimina (PEI) em fábricas 10 da camada de células. As proteínas segregadas no litros de volumes de meio condicionado são concentrados em quantidades administráveis usando filtração de fluxo tangencial, seguido de purificação por anti-HA cromatografia de afinidade. A utilidade desta plataforma é comprovada pela sua capacidade de expressar quantidades de miligramas de citocinas, receptores de citocinas, receptores da superfície celular, os factores de restrição intrínsecas, e glicoproteínas virais. Este método foi também utilizada com sucesso na determinação estrutural das 5,10 da glicoproteína triméricos Ebolavirus.
<p class = "jove_content"> Em conclusão, esta plataforma oferece facilidade de uso a velocidade e escalabilidade, maximizando a qualidade da proteína e funcionalidade. Além disso, nenhum equipamento adicional, que não seja um padrão humidificada incubadora de CO 2, é necessário. Este procedimento pode ser rapidamente expandido para sistemas de maior complexidade, tais como co-expressão de complexos de proteína, antigénios e anticorpos, produção de partículas semelhantes a vírus para as vacinas, ou a produção de adenovírus ou lentivírus para transdução de linhas de células difíceis.Protocol
Discussion
As fábricas 10-camada de células são um vaso eficaz para a produção de quantidades de miligramas de proteína. Uma grande vantagem de utilizar a fábrica celular sobre outros vasos tradicionais, tais como garrafas cilíndricas, frascos de agitação ou frascos giratórios, é que eles não requerem a aquisição de qualquer equipamento de laboratório adicional. Um padrão incubadora de CO 2 (aproximadamente 6,0 Cu. Ft) irá facilmente acomodar quatro fábricas 10 da camada de células (Fig. 2).<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um Tratamento HIV Ontario Rede de Pesquisa Operacional Grant (ROG-G645) e Canadian Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) para JEL, e da Universidade de Bolsas de Toronto para HA, FCA, e JDC. Os autores gostariam de agradecer Marnie Fusco, Dafna Abelson e Dr. Erica Ollmann Saphire no The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) para as células que fornecem, vetor de expressão Ebolavirus GP e conselhos gerais.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
