Enda oocyt bisulfit Mutagenes
Summary
Bisulfit mutagenes är den gyllene standarden för att analysera DNA-metylering. Vår modifierat protokoll tillåter DNA-metylering analys på encelliga nivå och har utformats särskilt för enskilda oocyter. Den kan också användas för klyvning-stegs-embryon.
Abstract
Epigenetik innebär att man måste ärftliga alla och reversibla modifieringar kromatin som alter-genen tillgänglighet, och sålunda är de primära mekanismerna för reglering av gentranskription 1. DNA-metylering är en epigenetisk modifiering som fungerar främst som en repressiv varumärke. Genom kovalent addition av en metylgrupp på cytosiner i CpG-dinukleotider, kan det rekrytera ytterligare undertryckande proteiner och histon modifieringar för att initiera processer involverade i kondensera kromatin och tysta gener 2. DNA-metylering är en förutsättning för normal utveckling som den spelar en avgörande roll i utvecklingsarbetet programmering, celldifferentiering, undertryckande av retrovirala element, X-kromosom inaktivering och genomisk prägling.
En av de mest kraftfulla metoder för DNA-metylering analys är bisulfit mutagenes. Natriumbisulfit är en DNA-mutagen som deaminerar cytosiner i uraciler. Efter PCR-amplifiering och seque ncing är dessa omvandlingshändelser identifieras som tyminer. Metylerade cytosiner skyddas från deaminering och därmed kvarstår som cytosiner, som möjliggör identifiering av DNA-metylering på individnivå nukleotid nivå 3. Utveckling av bisulfit mutagenes analysen har avancerat från de ursprungligen rapporterades 4-6 mot sådana som är mer känsliga och reproducerbar 7. En viktig utveckling var att bädda mindre mängder av DNA i en agaros pärla, och därigenom skydda DNA från den hårda bisulfit behandlingen 8. Detta möjliggjorde metylering analys som skall utföras på pooler av oocyter och blastocyst-stegs embryon 9. Den mest sofistikerade bisulfit mutagenes protokollet hittills är för enskilda blastocyst-stegs embryon 10. Eftersom blastocyster har i genomsnitt 64 celler (innehållande 120-720 pg av genomisk DNA), är denna metod inte effektiv för metylering studier om enskilda oocyter eller klyvning av karriären embryon.
tält "> Med ledtrådar från agaros inbäddning av min DNA belopp inklusive oocyter 11, här presenterar vi en metod där oocyter är direkt inbäddade i en agaros och lys lösningen sträng omedelbart efter hämtning och avlägsnande av zona pellucida från äggcellen. Detta gör att vi kan kringgå de två viktigaste utmaningarna i samma äggcell bisulfit mutagenes. skydda en liten mängd av DNA från nedbrytning och efterföljande förlust under många protokoll stegen viktigt som data erhålls från enstaka oocyter är frågan om PCR partiskhet i pooler elimineras dessutom. , oavsiktlig cumulus cellkontaminering kan detekteras med denna metod eftersom varje prov med mer än en metylering mönster kan uteslutas från analysen 12. Detta protokoll ger en förbättrad metod för framgångsrika och reproducerbara analyser av DNA-metylering vid encelliga nivå och är idealisk för enskilda oocyter samt klyvning av karriären embryon.Protocol
Discussion
Denna enda äggcell analys innehåller många steg med ett nummer som är kritiska och kräver särskild omsorg. Den första är äggcellen tvätt. Det är särskilt viktigt att tvätta varje oocyt flera gånger i färskt medium sjunker efter hyaluronidas behandling för att ta bort så många cumulusceller som möjligt. Dessutom, när överföring oocyter för att sura Tyrodes lösning för zona pellucida borttagning se omgivande mediet är fri från cumulus celler. Äggcellen är mycket klibbigt efter zona bort, och a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av University of Western Ontario, Institutionen för obstetrik och gynekologi, och ett bidrag ER06-02-188 från den Ministryof forskning och innovation, Early forskare Award. MMD fick stöd av en CIHR utbildning i Reproduktion, tidig utveckling och påverkan på hälsan (REDIH) Graduate Scholarship.
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l. Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
