La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em> Escherichia Coli</em> En utilisant des tableaux synthétiques génétiques
Summary
Systématiques et à grande échelle de synthèse génétiques écrans d'interaction gène-gène (ou épistasie) peut être utilisé pour explorer la redondance génétique et la voie de la diaphonie. Ici, nous décrivons un haut débit quantitatif synthétique de la technologie génétique de dépistage tableau, appelé ESGA que nous avons développé pour élucider les relations épistatiques et l'exploration des réseaux d'interactions génétiques<em> Escherichia coli</em>.
Abstract
Phénotypes sont déterminés par une série complexe de physique (par exemple protéine-protéine) et fonctionnelle (p. ex gène-gène ou génétique) des interactions (GI) 1. Alors que les interactions physiques peuvent indiquer quelles protéines bactériennes sont associées sous forme de complexes, ils ne révèlent pas nécessairement la voie au niveau relationships1 fonctionnels. Écrans GI, dans lequel la croissance des doubles mutants porteurs de deux gènes délétés ou inactivés est mesurée et comparée aux simples mutants correspondants, peut éclairer les dépendances entre les loci épistatiques et donc de fournir un moyen pour interroger et découvrir de nouveaux liens fonctionnels 2. Cartes à grande échelle GI ont été rapportés pour les organismes eucaryotes comme les levures 3-7, mais les informations restent rares IG pour les procaryotes 8, ce qui entrave l'annotation fonctionnelle des génomes bactériens. À cette fin, nous et d'autres avons développé à haut débit quantitatives bactériennes méthodes de dépistage GI 9, 10 </sup>.
Nous présentons ici les principales étapes requises pour effectuer quantitative E. coli synthétique procédure de dépistage génétique Array (ESGA) sur une échelle du génome 9, en utilisant la conjugaison bactérienne naturelle et la recombinaison homologue pour générer et systémique pour évaluer la justesse d'un grand nombre de doubles mutants dans un format de tableau colonie. bref, un robot est utilisé pour transférer , grâce à la conjugaison, le chloramphénicol (Cm) – a marqué allèles mutants de Hfr ingénierie (haute fréquence de recombinaison) «souches donateurs dans un ensemble ordonné de kanamycine (Kan) – marqués F-bénéficiaires souches. Typiquement, nous utilisons la perte de fonction simples mutants portant des délétions de gènes non essentiels (par exemple, la collection «Keio '11) et des mutations de gènes essentiels hypomorphes (allèles conférant à savoir l'expression des protéines réduite, la stabilité ou l'activité 9, 12, 13) interroger les associations fonctionnelles de gènes non essentiels et indispensables, respectivement. Après conjugaison et qui a suivi l'échange génétique induite par recombinaison homologue, les mutants résultants doubles sont sélectionnés sur milieu solide contenant deux antibiotiques. Après conséquence, les plaques sont numériquement imagée et la taille des colonies sont quantitativement classé par un système interne automatisé de traitement d'image 14. Les IG sont révélés lorsque le taux de croissance d'un double mutant est soit significativement meilleure ou pire que 9 attendu. Aggravante (ou négative) des IG entraînent souvent entre la perte de fonction des mutations dans les gènes de paires de voies compensatoires qui empiètent sur le même processus essentiel 2. Ici, la perte d'un seul gène est tamponnée, de sorte que soit seul mutant est viable. Cependant, la perte des deux voies est délétère et les résultats de létalité synthétique ou de maladie (c.-à croissance lente). A l'inverse, apaisantes (ou positif) des interactions entre les gènes peuvent se produire dans la même voie ou de protéines complexes 2 commedélétion de gène supporte seul est souvent suffisante pour perturber le fonctionnement normal de la voie ou complexes tels que des perturbations supplémentaires ne réduisent pas l'activité, et donc la croissance, en outre. Dans l'ensemble, l'identification systématique et l'analyse des réseaux IG peut fournir sans parti pris, des cartes mondiales des relations fonctionnelles entre un grand nombre de gènes, d'où la voie au niveau de l'information manquée par d'autres approches peuvent être inférées 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons établi un protocole étape par étape pour l'utilisation de robotique de dépistage ESGA pour enquêter sur les fonctions des gènes bactériens à un niveau voie en interrogeant GI. Cette approche peut être utilisée pour étudier les gènes individuels ainsi que les systèmes biologiques entières dans E. coli. Attentivement l'exécution des étapes expérimentales décrites ci-dessus, y compris tous les contrôles appropriés, et rigoureusement l'analyse et la validation des données…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds de Génome Canada, l'Ontario Genomics Institute, et les Instituts de recherche en santé subventions à JG et AE AG est récipiendaire de bourses d'études supérieures du Canada Vanier.
Materials
| I. Antibiotics | 2 | 36471 Remove |
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| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | 3 | 36472 Remove |
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| Kanamycin | #KAN201 | 4 | 36480 Remove |
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| Ampicillin | # AMP201 | 5 | 36473 Remove |
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| 2. Luria-Bertani medium | 6 | 36474 Remove |
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| LB powder | Bioshop | #LBL405 | 7 | 36478 Remove |
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| Agar | Bioshop | #AGR003 | 8 | 36481 Remove |
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| 3. Bacterial Strains and Plasmids | 9 | 36475 Remove |
||||
| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | 10 | 36476 Remove |
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| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | 11 | 36477 Remove |
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| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | 12 | 36479 Remove |
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| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | 13 | 36491 Remove |
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| 4. Primers | 14 | 36486 Remove |
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| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5′-GGCTGACATGGGAATTAGC-3′ R1: 5′-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3′ |
15 | 36482 Remove |
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| Desalted custom primers | Cm-R: 5′-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3′ Cm-F: 5′- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3′ |
16 | 36483 Remove |
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| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5′-CATATGAATATCCTCCTTA-3′ R2 constant region: 5′-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5’AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3′ S2 constant region: 5′- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3′ KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
17 | 36484 Remove |
|||
| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | 18 | 36485 Remove |
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| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | 19 | 36487 Remove |
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| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | 20 | 36488 Remove |
||
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | 21 | 36489 Remove |
||
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | 22 | 36490 Remove |
||
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | 23 | 36492 Remove |
||
| Loading dye | NEB | #B7021S | 24 | 36493 Remove |
||
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | 25 | 36497 Remove |
||
| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | 26 | 36494 Remove |
||
| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | 27 | 36495 Remove |
||
| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | 28 | 36496 Remove |
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| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | 29 | 36498 Remove |
||
| DNA ladder | NEB | #N3232L | 30 | 36499 Remove |
||
| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | 31 | 36500 Remove |
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| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | 32 | 36501 Remove |
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| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | 33 | 36502 Remove |
||
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | 34 | 36512 Remove |
||
| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | 35 | 36503 Remove |
||||
| Thermal cycler | BioRad, iCycler | 36 | 36504 Remove |
|||
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | 37 | 36505 Remove |
|||
| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | 38 | 36506 Remove |
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| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | 39 | 36507 Remove |
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| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | 40 | 36508 Remove |
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| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | 41 | 36519 Remove |
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| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | 42 | 36509 Remove |
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| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | 43 | 36510 Remove |
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| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | 44 | 36511 Remove |
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| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | 45 | 36513 Remove |
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| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | 46 | 36514 Remove |
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| 8. Imaging Equipments | 47 | 36515 Remove |
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| Camera stand | Kaiser | 48 | 36516 Remove |
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| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | 49 | 36517 Remove |
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| Light boxes, Testrite 16″ x 24″ units | Testrite | 50 | 36527 Remove |
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| 9. Pads or Plates Recycling | 51 | 36518 Remove |
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| 10% bleach | Any Vendor | 52 | 36520 Remove |
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| 70% ethanol | Any Vendor | 53 | 36521 Remove |
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| Sterile distilled water | Any Vendor | 54 | 36522 Remove |
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| Flow hood | Any Vendor | 55 | 36523 Remove |
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| Ultraviolet lamp | Any Vendor | 56 | 36524 Remove |
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| 10. Labware | 57 | 36525 Remove |
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| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | 58 | 36526 Remove |
|||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | 59 | 36528 Remove |
|||
| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | 60 | 36529 Remove |
||
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | 61 | 36530 Remove |
||
| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | 62 | 36531 Remove |
||
| Rectangular Plates | Singer Instruments | 63 | 36532 Remove |
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| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | 64 | 36533 Remove |
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| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | 65 | 36535 Remove |
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| plates | ABgene | # AB-0580 | 66 | 36534 Remove |
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| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | 67 | 36537 Remove |
||
| -80 °C freezer | Any Vendor | 68 | 36536 Remove |
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