Formulations pour la lyophilisation des bactéries et leur influence sur la survie des cellules

Résumé

La lyophilisation est souvent un moyen facile et pratique d'obtenir des produits secs de cellules bactériennes viables. Un problème de ce processus est la survie cellulaire. Nous détaillons ici une procédure pour étudier comment la survie des cellules pendant la lyophilisation est influencée par les propriétés de la formulation utilisée.

Résumé

Eau cellulaire peut être retiré pour inactiver les microorganismes réversible pour faciliter le stockage. Une telle méthode de suppression est la lyophilisation, qui est considéré comme une méthode de déshydratation douce. Pour faciliter la survie des cellules pendant le séchage, les cellules sont souvent préparées à l'avance. La formulation forme une matrice qui intègre les cellules et les protège contre divers stress nuisibles imposées sur les cellules lors de la congélation et le séchage. Nous présentons ici une méthode générale pour évaluer le taux de survie des cellules après lyophilisation et nous l'illustrons en comparant les résultats obtenus avec quatre formulations différentes: le saccharose disaccharide, le saccharose dérivé polymère Ficoll PM400, et les polysaccharides respectifs hydroxyéthylcellulose (HEC ) et de l'hydroxypropyl méthyl cellulose (HPMC), sur deux souches de bactéries, de P. putida KT2440 et A. A6 chlorophenolicus. Dans ce travail, nous illustrons comment préparer des formulations pour la lyophilisation et la façon d'enquêter sur la mécaniqueismes de la survie des cellules après réhydratation en caractérisant la formulation en utilisant la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), les mesures de tension de surface, analyse aux rayons X et microscopie électronique et concernant ces données à taux de survie. Les polymères ont été choisis de façon à obtenir une structure monomère de la saccharose ressemblant à de polysaccharide correspondant à un des degrés divers. En utilisant cette méthode setup nous avons montré que les polymères peuvent soutenir la survie cellulaire aussi efficacement que disaccharides si certaines propriétés physiques de la formulation sont contrôlées ^1.

Protocole

1. La culture et la récolte de P. putida

1. Préparer un levain de Pseudomonas putida par inoculation de 100 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) avec une colonie de P. putida cellules cultivées sur agar supplémenté avec du bouillon de soja tryptique (TSA). Gardez la culture à 30 ° C sur une planche en secouant fixé à 130 rpm.
2. Après 7 h de transférer une fraction aliquote de l'équivalent de levain à 1/10 du volume final de la culture principale pour BST-milieu frais. Gardez les cellules à 30 ° C sur une planche en agitant à 130 rpm pendant 16 heures.
3. Après 16 h de croissance, les cellules sont récoltées par ....

Résultats

Le tableau 1 présente les données sur la composition de la formulation, des événements enregistrés par DSC thermiques pendant le chauffage des formulations congelées, de la structure des échantillons secs et de la tension superficielle des solutions de formulation. Le T _g 'de saccharose a été déterminé à -40 ° C ^{2, 3} et peut être difficile à détecter pour les concentrations de saccharose inférieure à 20% p / p. L'événement thermique à -35 ° C est probablement liée .......

Discussion

Le motif de cette étude était d'étudier certaines propriétés de formulation qui peuvent être d'importance pour la survie des cellules pendant la lyophilisation. Bien que la tolérance intrinsèque de séchage varie selon les espèces, comme illustré à la figure 1A, la tendance de la façon dont les formulations différentes soutien survie cellulaire est similaire. Il est instructif de commencer par une comparaison de saccharose et de Ficoll. On croit qu'un facteur clé pour une formulation à souten.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Don offert par Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Don offert par le Département de pharmacie, Université d'Uppsala
Saccharose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Bouillon de soja tryptique	Merck	105459
Agar de soja tryptique	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Diffractomètre Bruker AXS SMART CCD 1k	Bruker	N.A
FIB/SEM à double faisceau FEI Strata DB235	FEI	N.A
Tensiomètre éducatif Krüss	Krüss	N.A.