The Green Monster Verfahren zur Erzeugung von Hefestämmen Buchwert Multiple Deletionen
Summary
Das Green Monster Verfahren ermöglicht die schnelle Montage mehrerer Deletionen mit einem Reporter-Gen kodiert grün fluoreszierendes Protein markiert. Dieses Verfahren basiert auf der Fahrt Hefestämme durch wiederholte Zyklen von sexueller Sortiment von Deletionen und Fluoreszenz-basierter Anreicherung von Zellen, die mehrere Deletionen basiert.
Abstract
Phänotypen für eine Gendeletion angesehen offenbart nur, wenn die Mutation in einem bestimmten genetischen Hintergrund oder Umgebungsbedingung 1,2 getestet wird. Es gibt Beispiele, wo viele Gene müssen gelöscht zu entlarven versteckte Genfunktionen 3,4 werden. Trotz des Potenzials für wichtige Entdeckungen werden genetische Interaktionen mit drei oder mehr Gene weitgehend unerforscht. Ausgiebige Recherchen Multi-Mutante Interaktionen wäre unpraktisch aufgrund der schieren Anzahl der möglichen Kombinationen von Deletionen. Jedoch würde Untersuchungen ausgewählter Sätze von Genen wie Sätze von Paraloge mit einer größeren Wahrscheinlichkeit von vornherein mit einer gemeinsamen Funktion, informativ sein.
In der Hefe Saccharomyces cerevisiae, wird Gen-Knockout durch Ersetzen eines Gens mit einem selektierbaren Marker über homologe Rekombination erfolgt. Da die Anzahl der Markierungen begrenzt ist, wurden Verfahren zum Entfernen und Wiederverwenden des sam entwickelt e Marker 5,6,7,8,9,10. Jedoch ist sequentiell Engineering multiple Mutationen unter Verwendung dieser Verfahren zeitaufwendig, da die Zeit linear mit der Anzahl der Löschungen zu erzeugenden erforderlich.
Hier beschreiben wir die Green Monster Verfahren für die routinemäßige Engineering multiple Deletionen in Hefe 11. In diesem Verfahren wird ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Reporters in Deletionen integriert quantitativ Etikett Stämme gemäß der Anzahl von Deletionen in jedem Stamm enthielten (Abb. 1) verwendet. Wiederholte Runden des Sortiments von GFP-markierten Deletionen über Hefe Paarung und Meiose mit durchflusszytometrische Anreicherung von Stämmen mit mehreren dieser Deletionen führen zu einer Anhäufung von Deletionen in Stämmen (Abbildung 2) gekoppelt ist. Durchführen mehrerer Prozesse parallel mit jedem Prozess, die eine oder mehrere Deletionen pro Runde, verringert die für die Stamm Konstruktion erforderlich.
Inhalt "> Der erste Schritt zur Vorbereitung haploid Single-Mutanten genannt ist 'ProMonsters,' von denen jeder trägt einen GFP-Reporter in einem gelöschten Locus und einer der" Toolkit "loci, entweder Green Monster GMToolkit-a oder GMToolkit-α an der . can1Δ Locus (Abbildung 3) Verwenden von Stämmen aus der Hefe Deletion Sammlung 12 kann GFP-markierten Deletionen zweckmäßigerweise durch Ersetzen des existierenden gemeinsamen kanMX4 Kassette in diesen Stämmen mit einem Universal-GFP generiert – URA3 Fragment Jeder GMToolkit enthält:. entweder der a – oder α-Mating-typspezifischen haploiden Selektionsmarker 1 und genau eine der beiden Marker, dass, wenn beide GMToolkits vorhanden sind, kollektiv für die Auswahl der Diploide ermöglichen.Der zweite Schritt besteht in der Durchführung der sexuellen Rad durch die Deletion Loci innerhalb einer einzelnen Zelle durch den zufälligen Auswahl und / oder meiotischen Recomb kombinierbarination, die jeden Zyklus der Paarung und Sporulation begleitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als wir das Green Monster Ansatz entwickelt, wurden wir mit der Möglichkeit der Rekombination zwischen verschiedenen GFP Ersatzkassetten betroffenen, was zu Genom-Umlagerung. Milderung gegen diese Möglichkeit ist unsere Auswahl für Zellen, die erfolgreich mehrere Runden der Paarung und Meiose durchlaufen haben. Zellen, die umgeordnet Genome sind voraussichtlich weniger fit nach der Paarung zu Zellen ohne eine identische Umlagerung. In der Tat haben wir nicht beobachten Genominstabilität aus Rekombination zwischen GF…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der US Defense Advanced Research Projects Agency Vertrag N66001-12-C-4039 um YS, einen Zuschuss von der Alfred P. Sloan Foundation, RSL, und US-amerikanischen National Institutes of Health Zuschüsse R01 HG003224 und R21 CA130266 um FPRFPR unterstützt wurde auch durch ein Stipendium vom kanadischen Institut für Advanced Research und von der Canada Exzellenzinitiative Forschung Chairs-Programm unterstützt.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
| Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria cell sorter | BD | ||
| MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
| Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |
References
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