Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple
Summary
Il metodo Green Monster consente l'assemblaggio rapido di delezioni multiple contrassegnati con un reporter gene codificante proteina fluorescente verde. Questo metodo si basa sulla guida ceppi di lievito attraverso cicli ripetuti di assortimento sessuale di delezioni e basato sulla fluorescenza arricchimento di cellule che trasportano più eliminazioni.
Abstract
Fenotipi di una delezione del gene sono spesso rivelati solo quando la mutazione viene testato in un contesto particolare genetica o 1,2 condizione ambientale. Ci sono esempi in cui molti geni devono essere eliminati per smascherare le funzioni del gene nascoste 3,4. Nonostante il potenziale di scoperte importanti, interazioni genetiche che coinvolgono tre o più geni sono in gran parte inesplorate. Ricerche esaustive di multi-mutanti interazioni sarebbe impraticabile a causa del gran numero di possibili combinazioni di delezioni. Tuttavia, studi di insiemi di geni selezionati, quali giochi di paraloghi con una maggiore possibilità di scambio priori una funzione comune, sarebbe informativo.
Nel lievito Saccharomyces cerevisiae, knockout gene è realizzato sostituendo un gene con un marcatore selezionabile tramite ricombinazione omologa. Poiché il numero di marcatori è limitata, sono stati sviluppati metodi per rimuovere e riutilizzare il sam 5,6,7,8,9,10 e marcatore. Tuttavia, sequenzialmente mutazioni ingegneria multipli utilizzando questi metodi richiede tempo perché il tempo richiesto scale linearmente con il numero di delezioni da generare.
Qui si descrive il metodo Verde Monster per routine ingegnerizzazione molteplici delezioni nel lievito 11. In questo metodo, una proteina verde fluorescente (GFP) reporter integrato in delezioni viene utilizzato per quantitativamente ceppi etichette secondo il numero delle delezioni contenuti in ogni ceppo (Figura 1). Cicli ripetuti di assortimento di GFP-segnate delezioni tramite accoppiamento lievito e meiosi accoppiato con citometria a flusso arricchimento di ceppi che trasportano più di queste delezioni portare all'accumulo di delezioni in ceppi (Figura 2). Esecuzione di più processi in parallelo, con ogni processo che incorpora uno o più delezioni per round, riduce il tempo richiesto per la costruzione ceppo.
contenuto "> Il primo passo è quello di preparare aploidi singolo mutanti chiamato 'ProMonsters,' ciascuno dei quali porta un reporter GFP in un luogo cancellato e uno dei 'toolkit' loci-sia-una GMToolkit verde Monster o GMToolkit-α al . can1Δ locus (Figura 3) utilizzando ceppi della collezione delezione lievito 12, GFP-marcate delezioni possono essere convenientemente generato sostituendo il comune KanMX4 cassetta esistente in questi ceppi con un universale GFP – URA3 frammento Ogni GMToolkit contiene:. sia l'una – o α-accoppiamento di tipo-specifico marcatore di selezione aploide 1 ed esattamente uno dei due marcatori che, quando entrambi sono presenti GMToolkits, collettivamente permettere una selezione di diploidi.Il secondo passo è quello di effettuare il ciclismo sessuale attraverso cui loci cancellare possono essere combinate in una singola cellula dal assortimento casuale e / o recomb meioticaminazione che accompagna ogni ciclo di accoppiamento e la sporulazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come abbiamo sviluppato l'approccio verde mostro, eravamo preoccupati con la possibilità di ricombinazione tra i diversi cassetti di ricambio GFP, con conseguente riarrangiamento del genoma. Attenuare contro questa possibilità è la selezione per le cellule che hanno superato con successo a vari cicli di accoppiamento e meiosi. Cellule recanti genomi riarrangiati dovrebbero essere meno misura dopo l'accoppiamento di cellule senza un riarrangiamento identica. In effetti, non abbiamo osservato alcuna instabilit?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal contratto US Research Projects Agency Defense N66001-12-C-4039 a YS, un finanziamento della Alfred P. Sloan Foundation per RSL, e US National Institutes of concede Salute HG003224 R01 e R21 CA130266 a FPRFPR era supportato anche da una borsa di studio presso l'Istituto canadese per la ricerca avanzata e per l'eccellenza di ricerca del Canada programma di sedie.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
| Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria cell sorter | BD | ||
| MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
| Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |
References
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