Den gröna monster Process för generering av jäststammar Redovisat flera Gene Strykningar
Summary
Den gröna monster Metoden möjliggör snabb montering av flera deletioner markerade med en reportergen som kodar grönfluorescerande protein. Denna metod bygger på att köra jäststammar genom upprepade cykler av sexuell sortiment av strykningar och fluorescens-baserade anrikning av celler som bär fler strykningar.
Abstract
Fenotyper för en gendeletion ofta avslöjas endast när mutationen testas i en viss genetisk bakgrund eller miljöförhållanden 1,2. Det finns exempel där många gener måste bort för att avslöja dolda genfunktioner 3,4. Trots risken för viktiga upptäckter, är genetiska interaktioner mellan tre eller flera gener i stort sett outforskat. Uttömmande sökningar i flera muterade interaktioner skulle vara opraktiskt på grund av det stora antalet möjliga kombinationer av strykningar. Skulle dock studier av utvalda uppsättningar av gener, som uppsättningar paraloger med större a priori chans att dela en gemensam funktion, vara informativ.
I jästen Saccharomyces cerevisiae, är genen knockout åstadkoms genom att ersätta en gen med en selekterbar markör via homolog rekombination. Eftersom antalet markörer är begränsad, har metoder utvecklats för att avlägsna och återanvända sam e markör 5,6,7,8,9,10. Emellertid är sekventiellt teknik multipla mutationer med användning av dessa metoder tidsödande, eftersom den tid som krävs skalor linjärt med antalet deletioner genereras.
Här beskriver vi den gröna monster metoden för rutinmässigt konstruerar flera strykningar i jäst 11. I denna metod, är ett grönt fluorescerande protein (GFP) reporter integreras deletioner används för att kvantitativt märka stammar enligt antalet deletioner ingår i varje stam (Figur 1). Upprepade omgångar sortiment av GFP märkta-strykningar via jäst parning och meios tillsammans med flödes-cytometrisk anrikning av stammar som bär flera av dessa strykningar leder till ackumulering av deletioner i stammar (Figur 2). Utföra flera processer parallellt, med varje process innefattande en eller flera deletioner per runda, minskar tiden som krävs för stam konstruktion.
innehåll "> Det första steget är att förbereda haploida singel-mutanter kallade" ProMonsters, "var och en bär en GFP reporter i en borttagen lokus och en av de" verktygslåda "loci, antingen gröna monster GMToolkit-a eller GMToolkit-α på . can1Δ lokus (figur 3) Använda stammar från jästen radering samlingen 12, kan GFP-märkta deletioner lämpligen genereras genom att ersätta den vanliga KanMX4 kassetten finns i dessa stammar med en universell GFP – URA3-fragmentet Varje GMToolkit innehåller:. antingen a – eller α-parning-typ-specifik haploida selektionsmarkör 1 och exakt en av de två markörerna som, när båda GMToolkits är närvarande, tillsammans medger selektion av diploider.Det andra steget är att utföra sexuella cykling genom vilken radering loci kan kombineras i en enda cell genom den slumpmässiga sorteringen och / eller meiotiska recombnering som medföljer varje cykel av parning och sporulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
När vi utvecklade den gröna monster synsätt vi sysslar med möjlighet till rekombination mellan olika kassetter GFP ersättning, vilket leder till genomet omlagring. Mildra mot denna möjlighet är vårt urval av celler som framgångsrikt har genomgått flera omgångar av parning och meios. Celler som bär omlagrade genomen förväntas vara mindre passform efter parning till celler utan en identisk omlagring. Faktum, vi observerar någon genomet instabilitet till följd av rekombination mellan GFP kassetter 11.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av USA Defense Advanced Research Projects Agency kontrakt N66001-12-C-4039 till YS, ett anslag från Alfred P. Sloan Foundation till RSL och amerikanska National Institutes of Health bidrag R01 HG003224 och R21 CA130266 till FPRFPR var också stöds av en gemenskap från den kanadensiska institutet för avancerad forskning och genom Kanadas Excellence Research Stolar programmet.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
| Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria cell sorter | BD | ||
| MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
| Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |
References
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science’s STKE. 294, 2364-23 (2001).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues. Génétique. 157, 1117 (2001).
- Wieczorke, R., et al. Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS letters. 464, 123-128 (1999).
- Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains. Génétique. 116, 541-545 (1987).
- Akada, R., et al. PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 399-405 (2006).
- Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic acids research. 24, 2519 (1996).
- Delneri, D., et al. Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system. Gene. 252, 127-135 (2000).
- Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).
- Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast. Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).
- Suzuki, Y., et al. Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection. Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).
- Winzeler, E. A. Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Woods, R. A., Gietz, R. D. High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast. Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).
- Hughes, T. R., et al. Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling. Nature. 25, 333-337 (2000).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15, 1541-1553 (1999).
- Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441, 840-846 (2006).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962 (2005).
