Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci
Summary
Yeşil Canavar yöntemi bir muhabir gen kodlaması yeşil flüoresan protein ile işaretlenmiş birden silme hızlı montaj sağlar. Bu yöntem, tekrarlanan delesyonlar cinsel çeşit döngüleri ve daha fazla silme taşıyan hücrelerin floresan merkezli zenginleştirme yoluyla maya suşu sürüş dayanmaktadır.
Abstract
Bir gen delesyonu için fenotipleri sık mutasyon belirli bir genetik arka plan veya çevre koşulu 1,2 test olduğunda ortaya çıkar. Birçok gen gizli gen fonksiyonlarının 3,4 maskesini düşürmeye silinmesi gerekir örnekleri vardır. Önemli buluşlar için potansiyeline rağmen, üç veya daha fazla geni içeren genetik etkileşimler büyük oranda araştırılmamıştır. Multi-mutant etkileşimleri kapsayan taramalar delesyonlar olası kombinasyonların çokluğu nedeniyle pratik olmaz. Bununla birlikte, böyle bir ortak işlev şekilde daha büyük bir önsel şans ile paraloglarına setleri gibi genler, seçilmiş kümelerinin çalışmalar bilgilendirici olacaktır.
Mayası Saccharomyces cerevisiae, gen nakavt homolog rekombinasyon yoluyla, seçilebilir bir işaretleyici gen ile değiştirilmesi ile gerçekleştirilir. Belirteçlerinin sayısı sınırlı olduğundan, yöntemler sam kaldırılması ve yeniden kullanmak için geliştirilmiştir e işaretleyici 5,6,7,8,9,10. Zaman elde edilmesi için silme sayısı ile doğrusal ölçekler gereken Bununla birlikte, bu yöntemler kullanılarak ardışık olarak çoklu mutasyonlarla mühendislik zaman alıcıdır.
Burada rutin maya 11 birden silme mühendisliği için Yeşil Canavar yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemde, silmeler içine entegre bir yeşil flöresanlı protein (GFP) raportör her bir suş içinde yer silme sayısı (Şekil 1) 'e göre kantitatif etiket suşları için kullanılır. Maya çiftleşme ve mayoz ile GFP işaretlenmiş delesyonlar ürün yelpazesine Tekrarlanan mermi suşlarında delesyonlar birikimi (Şekil 2) neden bu delesyonlar fazla taşıyan suşlarının akış sitometrik zenginleştirme ile birleştiğinde. , Tur başına bir veya daha fazla silme içeren her işlem ile paralel olarak çoklu süreçleri Sahne suşu yapımı için gereken süreyi azaltır.
content "> İlk adım haploit tek mutantlar adlandırdığı hazırlamaktır 'ProMonsters,' bir GFP silinmiş bir odağı muhabiri ve 'araç birini taşıyan her biri lokus-Ya Yeşil Canavar GMToolkit-Bir ya GMToolkit-α .. can1Δ yerinin (Şekil 3) maya silme toplama 12 den suşu kullanılarak, GFP-işaretli silmeler uygun bir evrensel GFP ile bu suşların içinde mevcut ortak KanMX4 kaset değiştirerek elde edilebilir – URA3 fragmanı her GMToolkit içerir: bir ya da – ya da α-çiftleşme-tipi-spesifik haploid seçim işaretleyici her ikisi de 1 ve tam olarak GMToolkits mevcut olduğunda, toplu olarak diploid seçimine izin veren, bu iki belirteçlerinden biri.İkinci adım, silme loci rasgele yelpazesine ve / veya mayotik recomb ile tek bir hücre içinde kombine edilebilir yoluyla cinsel bisiklet gerçekleştirmek için olançiftleşme ve sporlanma her döngüsünde eşlik asÙ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz Yeşil Canavar yaklaşım geliştirdi olarak, genom düzenlenmesi giden, farklı GFP yedek kasetler arasındaki rekombinasyon olasılığı ile ilgiliydi. Bu olasılığa karşı Azaltıcı başarıyla çiftleşme ve mayoz çok sayıda mermi geçirmiş hücreleri için bizim seçimdir. Düzenlenmeyecek genomları taşıyan hücreler özdeş düzenlenmesi olmadan hücrelerine çiftleşme sonrası daha az uyumlu olması beklenmektedir. Nitekim, biz GFP kasetler 11 arasındaki rekombinasyon kaynaklanan herha…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma FPRFPR için YS, rsl Alfred P. Sloan Vakfı tarafından sağlanan hibe ve Sağlık hibe US National Institutes R01 HG003224 ve R21 CA130266 için ABD Savunma Bakanlığı İleri Araştırma Projeleri Ajansı sözleşme N66001-12-C-4039 tarafından desteklenen oldu Ayrıca İleri Araştırma Kanada Enstitüsü bir burs ile ve Kanada Mükemmellik Araştırma Sandalyeler program tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
| Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria cell sorter | BD | ||
| MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
| Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |
References
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science’s STKE. 294, 2364-23 (2001).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues. Génétique. 157, 1117 (2001).
- Wieczorke, R., et al. Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS letters. 464, 123-128 (1999).
- Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains. Génétique. 116, 541-545 (1987).
- Akada, R., et al. PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 399-405 (2006).
- Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic acids research. 24, 2519 (1996).
- Delneri, D., et al. Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system. Gene. 252, 127-135 (2000).
- Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).
- Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast. Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).
- Suzuki, Y., et al. Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection. Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).
- Winzeler, E. A. Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Woods, R. A., Gietz, R. D. High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast. Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).
- Hughes, T. R., et al. Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling. Nature. 25, 333-337 (2000).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15, 1541-1553 (1999).
- Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441, 840-846 (2006).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962 (2005).
