Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em> In Situ</em> Hybridisierung (FISH)
Summary
Fluoreszierend<em> In situ</em> Hybridisierung (FISH) auf mRNA-Transkripte in den einzelnen Zellen zu identifizieren ermöglicht die Analyse von polygenen Tätigkeit wie die gleichzeitige Transkription von mehr als einem Mitglied der<em> Var</em> Multigenfamilie in<em> Plasmodium falciparum</em> Infizierten Erythrozyten<sup> 1</sup>. Die Technik ist anpassbar und kann bei verschiedenen Arten von Genen, Zellen und Organismen verwendet werden.
Abstract
Adhäsion von Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten (IE) für die menschliche endotheliale Rezeptoren bei Malaria-Infektionen durch Expression PfEMP1 Protein-Varianten durch die Gene kodiert var vermittelt.
Die haploiden P. falciparum Genoms beherbergt etwa 60 verschiedene Gene var von denen nur eine geglaubt hat, die pro Zelle zu einem Zeitpunkt während des Blut Stadium der Infektion transkribiert. Wie solche gegenseitig ausschließenden Regulierung der Gentranskription var erreicht ist unklar, da die Identifizierung einzelner Gene oder var Untergruppen von var Gene mit verschiedenen Rezeptoren und die Folge der unterschiedlichen Bindung auf das klinische Ergebnis von P. zugeordneten falciparum-Infektionen. Vor kurzem hat die gegenseitig ausschließende Transkription Paradigma in Zweifel durch Transkription Assays auf Basis einzelner P. aufgerufen falciparum transcript Identifikation in einzelnen infektiert erythrozytären Zellen unter Verwendung von RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von var Gentranskription durch den Parasiten im einzelnen Kerne von P. falciparum IE 1.
Wir beschreiben hier ein ausführliches Protokoll zur Durchführung des RNA-FISH-Methodik zur Analyse von var Gentranskription in Einzel-Kerne von P. falciparum infiziert menschliche Erythrozyten. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von Digoxigenin-Basis und Biotin-markierte Antisense-RNA-Sonden unter Verwendung der Fluoreszenz-Plus-TSA Palette System 2 (Perkin Elmer), mikroskopische Analysen und frisch ausgewählt P. falciparum IE. Die in situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, um Transkription und Regulation einer Vielzahl von Genen in den verschiedenen Phasen des P. ausgedrückt überwachen falciparum Lebenszyklus und ist anpassungsfähig an andere Malaria-Parasiten Arten und anderen Organismen und Zelltypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
FISH-Analyse RNA im Gegensatz zu Verfahren, wie Northern Blot und RT-PCR, erlaubt die Diskriminierung von spezifischen mRNA-Transkripte in der einzelnen Zelle. Dies macht es möglich, zwischen transkriptionell aktiven und inaktiven Zellen zu unterscheiden, in diesem Beispiel, P. parasitischen Protozoen falciparum in menschlichen roten Blutzellen. Solche whole-cell Beobachtungen sind oft notwendig und kann zu entwirren wichtige und neuartige transkriptionellen Mustern ein.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Michael Alifrangis und Ulla Abildtrup zur Genotypisierung von Parasiten und Christina Holm für hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde vom Howard Hughes Medical Institute (Zuschuss 55.005.511), The Lundbeck Foundation (R9-A840) und durch die Niels Bohr Foundation finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
| Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution |
| Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution |
| Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
| Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
| Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
| Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
| Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
| Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
| Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
| Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
| culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
| DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
| Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
| Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
| Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
| Hybridization solution: Denhardt’s 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
| Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt’s 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
| Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
| Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
| Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
| Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
| Nailpolish | Available in any drugstore | ||
| PBS 20x:NaCl
KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4
160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
| Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
| Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
| Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
| RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
| RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
| RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
| RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
| Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
| SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
| SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
| SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
| TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
| TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
| TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
| TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
| TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
| TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
| Tubes 14 ml sterile | Almeco – CM LAB Aps | 91016 |
References
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