Gentransfer in Oudere kippenembryo's door<em> Ex ovo</em> Elektroporatie
Summary
Werkwijze voor genoverdracht in kippenembryo's bij later stadium incubatie (ouder dan Hamburger Hamilton fase (HH) 22) beschreven. Deze methode overwint nadelen<em> In ovo</em> Elektroporatie toegepast op oudere kippen embryo's en is een nuttige techniek om genen functie en regelgeving op oudere ontwikkelingsstadia te bestuderen.
Abstract
De kip embryo biedt een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van gen-functie en regulatie tijdens de embryonale ontwikkeling. In ovo elektroporatie is een krachtige methode om overexpressie van exogene genen of endogene genen in vivo down-reguleren in kippenembryo's 1. Verschillende structuren zoals DNA plasmiden coderende genen 2-4 kleine interfererende RNA (siRNA) plasmiden 5 kleine kunststof RNA-oligo 6 en morfolino antisense oligonucleotiden 7 kan gemakkelijk worden getransfecteerd in kippenembryo door elektroporatie. Echter, de toepassing van in-ovo electroporatie beperkt tot embryo's in een vroeg stadium incubatie (jonger dan stadium HH20 – volgens Hamburg en Hamilton) 8 en er zijn enkele nadelen voor de toepassing ervan in embryo's in een later stadium (ouder dan stadium HH22 – ongeveer 3,5 dagen van de ontwikkeling). Bijvoorbeeld, de vitelline membraan in een later stadium is usubondgenoot vast aan de Shall membraan en het openen van een raam in de schelp veroorzaakt breuk van de schepen, de dood als gevolg van de embryo's; oudere embryo's worden gedekt door vitelline en allantoïs schepen, waar het moeilijk is om toegang te krijgen en manipuleren van de embryo's; oudere embryo's te verplaatsen krachtig en is het moeilijk om de oriëntatie te controleren door middel van een relatief klein venster in de shell.
In dit protocol tonen we aan een ex ovo elektroporatie methode voor gentransfer in kippenembryo's in de late stadia (ouder dan stadium HH22). Voor ex ovo elektroporatie, worden embryo's gekweekt in petrischalen 9 en de vitelline en allantoïs schepen worden op grote schaal verspreid. Onder de voorwaarden, worden de oudere kippenembryo's gemakkelijk bereikbaar en gemanipuleerd. Derhalve is deze methode overwint de nadelen van in ovo elektroporatie op de oudere kippenembryo's. Met deze methode kan plasmiden getransfecteerd gemakkelijk in verschillende delenvan de oude kippenembryo's 10-12.
Protocol
Discussion
Dit protocol geeft een leidraad voor gentransfer in oudere kippenembryo's (bijvoorbeeld in de optische tectum op E6) door ex ovo elektroporatie. Deze methode breidt het gebruik van elektroporatie oudere kippen embryo's en kunnen eenvoudig worden toegepast voor het bestuderen vele laboratoria genfunctie in vivo in een later stadium. Embryo van E4 tenminste E7 succes kan worden geëlektroporeerd met deze methode de geëlektroporeerde embryo's overleving tot E15 11. Naast de hersene…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Duitse Research Foundation (DFG, LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
| Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neurosciences. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
