Transferencia de genes en embriones de pollo por los mayores<em> Ex ovo</em> La electroporación
Summary
Un método de transferencia de genes en embriones de pollo en las etapas posteriores de incubación (de más de Hamburger y Hamilton etapa (HH) 22) se describe. Este método supera las desventajas de<em> In ovo</emElectroporación> se aplica a los embriones de pollo y de más edad es una técnica útil para estudiar la función génica y regulación de los últimos estadíos de desarrollo.
Abstract
El embrión de pollo constituye un modelo excelente para estudiar la función génica y regulación durante el desarrollo embrionario. En la electroporación in ovo es un poderoso método para sobre-expresan genes exógenos o hacia abajo de regular los genes endógenos en vivo en 1 embriones de pollo. Las diferentes estructuras, tales como genes de ADN plásmidos que codifican 2-4, pequeños ARN de interferencia (siRNA), plásmidos 5, pequeña síntesis de ARN oligos 6, y los oligonucleótidos antisentido morpholino 7 puede ser fácilmente transfectadas en embriones de pollo por electroporación. Sin embargo, la aplicación de la electroporación in ovo en el se limita a los embriones en las fases iniciales de incubación (menor que en el estadio HH20 – de acuerdo a Hamburgo y Hamilton) 8 y hay algunas desventajas para su aplicación en los embriones en etapas posteriores (mayor que en el estadio HH22 – aproximadamente 3,5 días de desarrollo). Por ejemplo, la membrana vitelina en etapas posteriores es USUaliado pegado a la membrana debe y abrir una ventana en la cáscara provoca la ruptura de los vasos, lo que resulta en la muerte de los embriones; los embriones más viejos están cubiertos por los buques vitelino y alantoideo, donde es difícil acceder y manipular los embriones; los embriones más viejos se mueven vigorosamente y es difícil de controlar la orientación a través de una ventana relativamente pequeña en la cáscara.
En este protocolo se demuestra un método de electroporación in ovo ex de transferencia de genes en embriones de pollo en las etapas finales (más que en el estadio HH22). Para la electroporación in ovo ex, los embriones se cultivaron en placas de Petri de 9 y el vitelino y los vasos alantoideo se extendió ampliamente. Bajo estas condiciones, los embriones de pollo mayores son fácilmente accesibles y manipulado. Por lo tanto, este método supera las desventajas de electroporación in ovo en aplicar a los embriones de pollo mayores. Usando este método, los plásmidos pueden ser fácilmente transfectadas en diferentes partesde los embriones de pollo mayores 10-12.
Protocol
Discussion
Este protocolo proporciona una guía para la transferencia de genes en embriones de pollo mayores (por ejemplo, en el techo óptico en E6) mediante electroporación in ovo ex. Este método se extiende el uso de electroporación para embriones de pollo mayores y puede ser fácilmente aplicado a muchos laboratorios para estudiar la función génica de vivo en etapas posteriores. Los embriones de E4 a menos E7 puede ser satisfactoriamente electroporación por este método y los embriones electrop…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Alemana de Investigación (DFG; LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
| Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neurosciences. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
