Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em> Ex ovo</em> Elektroporasyon
Summary
Daha sonra kuluçka dönemlerinde (Hamburger ve Hamilton evresi (SS) 22 yaşından büyük) az tavuk embriyosu gen transferi yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, dezavantajların üstesinden<em> Ovo içinde</em> Elektroporasyon büyük tavuk embriyo uygulanan ve gen fonksiyonu ve büyük gelişim aşamalarında yönetmelik çalışmak için yararlı bir tekniktir.
Abstract
Tavuk embriyo embriyonik gelişim sırasında gen fonksiyonu ve regülasyonu çalışmak için mükemmel bir model sistemi sağlar. Ovo elektroporasyon içinde güçlü bir aşırı-express ekzojen genlerin yöntemi veya tavuk embriyo 1 in vivo olarak endojen genlerin aşağı düzenlenmesi. DNA plazmid kodlama genleri 2-4, küçük müdahale RNA (siRNA) plazmidleri 5, küçük sentetik RNA oligos 6 ve morfolino antisens oligonükleotidler 7 gibi farklı yapılar kolaylıkla elektroporasyonla tavuk embriyosu transfekte edilebilir. Ancak, ovo elektroporasyon yılında uygulanması erken kuluçka evrelerinde (evre HH20 daha genç – Hamburg ve Hamilton göre) az embriyo ile sınırlıdır 8 ve sonraki aşamalarında embriyo yılında uygulama için bazı dezavantajları (evre HH22 büyük var – yaklaşık 3.5 kalkınma gün). Örneğin, daha sonraki aşamalarda vitellin membran usu olanshall membran yapışmış ve kabuk bir pencere açarak müttefiki embriyoların ölümle sonuçlanan, damarların yırtılması neden olur; eski embriyolar bu embriyolar erişmek ve işlemek için zordur vitellin ve allantoik damarları ile kaplıdır; eski embriyo hareket kabuk nispeten küçük bir pencereden yönü şiddetle kontrol etmek zordur ve olup.
Bu protokol; geç evrede (evre HH22 daha eski) az tavuk embriyosu gen transferi için bir ex ovo elektroporasyon yöntemi göstermektedir. Ex ovo elektroporasyon için, embriyolar Petri 9 kültüre ve vitellin ve allantoik damarları yaygın olarak yayılır. Bu koşullar altında, büyük tavuk embriyo kolayca erişilebilir ve manipüle edilmiştir. Bu nedenle, bu yöntem, daha eski tavuk embriyo uygulanan ovo elektroporasyon de bir sakıncaları ortadan kaldırmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, plazmidler kolayca farklı bölüme transfekte edilebilirbüyük tavuk embriyo 10-12.
Protocol
Discussion
Bu protokol ex ovo elektroporasyonla büyük tavuk embriyo (örneğin, E6 de optik tectum içine) gen transferi için bir kılavuz sağlar. Bu yöntem, büyük tavuk embriyo elektroporasyonla kullanılması uzanır ve kolay bir sonraki aşamada, in vivo gen fonksiyonu olarak incelemek için çok laboratuar uygulanabilir. E4 en az E7 için başarılı bir şekilde Embriyolar bu yöntem tarafından electroporated edilebilir ve electroporated embriyosu E15 11 kadar sağkalım olabilir. Beynin y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (; LU1455/1-1 DFG) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
| Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neurosciences. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
