La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell'ipossia sulla<em> C. elegans</em
Summary
Questo paper come utilizzare camere di ipossia a flusso continuo per generare atmosfere con concentrazioni definite di O<sub> 2</sub> Per capire le risposte biologiche a una riduzione dei O<sub> 2</sub>. Questo sistema è facile da installare e mantenere, e sufficientemente flessibile per adattarsi ad una vasta gamma di O<sub> 2</sub> Concentrazioni e sistemi modello
Abstract
L'ossigeno è essenziale per tutti i metazoi per sopravvivere, con una sola eccezione nota 1. Diminuzione O 2 disponibilità (ipossia) possono sorgere durante gli stati di malattia, sviluppo normale o variazioni delle condizioni ambientali 2-5. Comprendere le vie di segnalazione cellulare che sono coinvolti nella risposta all'ipossia potrebbe fornire una nuova visione strategie terapeutiche per diverse patologie umane, da ictus al cancro. Questo obiettivo è stato impedito, almeno in parte, le difficoltà tecniche connesse con l'esposizione controllata ipossica in organismi modello geneticamente suscettibili.
Il nematode Caenorhabditis elegans è ideale come organismo modello per lo studio della risposta ipossica, come è facile alla cultura e manipolare geneticamente. Inoltre, è possibile studiare le risposte cellulari a specifici ipossiche O 2 concentrazioni senza effetti confondenti da C. elegans ottenere O 2 (e altri gas) per diffusione, in contrapposizione ad un sistema respiratorio facilitato 6. Fattori note per essere coinvolte nella risposta ad ipossia sono conservati in C. elegans. La reale risposta al ipossia dipende dalla concentrazione specifica di O 2 che è disponibile. In C. elegans, l'esposizione a moderare l'ipossia provoca una risposta trascrizionale mediata in gran parte da HIF-1, i altamente conservate ipossia-inducibile fattore di trascrizione 6-9. C. elegans. embrioni richiedono HIF-1 per sopravvivere in 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . L'ipossia è un termine generico per "inferiore al normale O 2". Normossia (normale O 2) può anche essere difficile da definire. In genere consideriamo aria della stanza, che è 210.000 ppm O 2 per essere normossia. Tuttavia, è stato dimostrato che C. elegans ha una preferenza comportamentale per le concentrazioni di O 2 da 5-12% 50,000-120,000 ppm (O 2) 11. In larvae e adulti, HIF-1 agisce per prevenire l'ipossia indotta diapausa in ppm O 5000 2 12. Tuttavia, HIF-1 non gioca un ruolo nella risposta a concentrazioni più basse di O 2 (anossia, definizione operativa <10 ppm O 2) 13. In anossia, C. elegans entra in uno stato reversibile di animazione sospesa, in cui tutte le attività microscopicamente osservabile cessa 10. Il fatto che le diverse risposte fisiologiche si verificano in condizioni diverse evidenzia l'importanza di avere il controllo sperimentale sulla concentrazione di O 2 ipossica.
Qui, viene presentato un metodo per la realizzazione e la realizzazione di camere ambientali che producono condizioni di ipossia affidabili e riproducibili con concentrazioni definite di O 2. Il metodo flusso continuo assicura un rapido equilibrio della camera e aumenta la stabilità del sistema. Inoltre, la trasparenza el'accessibilità delle camere permettono la visualizzazione diretta di animali esposti a ipossia. Si illustra, inoltre, un efficace metodo di raccolta C. elegans campioni rapidamente dopo l'esposizione a ipossia, che è necessario osservare molte delle rapidamente invertiti cambiamenti che si verificano in ipossia 10,14. Questo metodo fornisce un fondamento di base che può essere facilmente modificato per esigenze di laboratorio individuali, compresi i sistemi di modelli diversi e una varietà di gas.
Protocol
Discussion
Questo metodo presenta una strategia per la costruzione di un ambiente ipossico che consente di ambienti con precise concentrazioni di ossigeno per essere mantenute in laboratorio. Queste camere di fornire un metodo semplice per esporre organismi a specifiche concentrazioni basse di O 2 e di controllo delle uscite molecolari e fisiologiche. La camera ambientale descritta è assemblato da laboratorio invece acquistabile e può quindi essere modificata per adattarsi alle esigenze dell'esperimento.
<p cl…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio di Miller per la discussione e lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un premio nuovo investigatore del Centro Shock Nathan di Eccellenza nella biologia di base di invecchiamento DLM e il National Institutes of award Salute R00 AG030550 di DLM.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon |
YO-95821-00 (1/8″ FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8″ PTFE)’ R-3603 |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16″) 06363-62 (F. coupler 1/16″) 06363-60 (M. coupler 1/8″) 06363-61 (F. coupler 1/8″) |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16″) |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4″ nut) B-200-3 (1/8″ union tee) B-400-set (1/4″ ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8″ male conn) |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
References
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