Oprettelse af Definerede Gasformige Miljøer at studere effekten af hypoxi på<em> C. elegans</em
Summary
Dette papir detaljer hvordan du bruger kontinuerlig-flow hypoxi kamre til at skabe atmosfære med definerede koncentrationer af O<sub> 2</sub> At forstå biologiske reaktioner på nedsat O<sub> 2</sub>. Dette system er let at installere og vedligeholde, og fleksibel nok til at passe en bred vifte af O<sub> 2</sub> Koncentrationer og modelsystemer
Abstract
Ilt er afgørende for alle metazoans at overleve, med en kendt undtagelse 1. Nedsat O 2 værelser (hypoxi) kan opstå under tilstande af sygdom, normal udvikling eller ændringer i de miljømæssige forhold 2-5. Forståelse af de cellulære signalveje, der er involveret i respons på hypoxi kan give ny indsigt i behandling strategier for forskellige humane patologier, fra slagtilfælde til kræft. Dette mål er blevet hæmmet i det mindste delvis af tekniske vanskeligheder i forbindelse med kontrolleret hypoksisk eksponering i genetisk modtagelige modelorganismer.
Nematoden Caenorhabditis elegans er velegnet som en model organisme til undersøgelse af hypoxisk reaktion, da det er let at dyrke og genetisk manipulation. Desuden er det muligt at studere cellulære reaktioner på specifikke hypoxiske O 2 koncentrationer uden forstyrrende virkninger, da C. elegans opnåelse O2 (og andre gasser) ved diffusion, i modsætning til et forenklet åndedrætsorganerne 6. Faktorer, der vides at være involveret i respons på hypoxi, er konserveret i C. elegans. Den faktiske respons på hypoxi afhænger af den specifikke koncentrationen af O2, der er til rådighed. I C. elegans, udsættelse for moderat hypoksi fremkalder en transkriptionel reaktion medieret høj grad af HIF-1, de stærkt konserverede hypoksi-inducerbar transkription faktor 6-9. c. elegans embryoer krav HIF-1 til at overleve i 5,000-20,000 ppm O2 7,10 . Hypoksi er en generel betegnelse for "mindre end normal O 2". Normoxi (normal O 2) kan også være svært at definere. Vi finder generelt rumluft, der er 210 tusind ppm O2 er normoxi. Imidlertid har det vist sig, at C. elegans har adfærdsmæssige præference for O 2-koncentrationer fra 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. I larvae og voksne, HIF-1 handlinger for at forhindre hypoksi-induceret diapause i 5.000 ppm O 2 12. Imidlertid HIF-1 ikke spiller en rolle i reaktionen til lavere koncentrationer af O2 (anoxi, operationel definition <10 ppm O2) 13. I anoxi, C. elegans indgår en reversibel tilstand af suspenderet animation, hvor al mikroskopisk observerbare aktivitet ophører 10. Den kendsgerning, at forskellige fysiologiske reaktioner forekommer i forskellige forhold understreger vigtigheden af at have eksperimentel kontrol over den hypoxiske koncentrationen af O2.
Her præsenterer vi en metode til konstruktion og implementering af miljøkamre der producerer pålidelige og reproducerbare hypoxisk betingelser med veldefinerede koncentrationer af O 2. Den kontinuerlig metode sikrer hurtig ækvilibrering af kammeret og forøger stabiliteten af systemet. Derudover, gennemsigtighed ogtilgængelighed af kamrene muliggøre direkte visualisering af dyr blev udsat for hypoxi. Vi yderligere at demonstrere en effektiv metode til høst C. elegans prøver hurtigt efter udsættelse for hypoxi, hvilket er nødvendigt for at observere mange af de hurtigt-tilbageførte forandringer, der sker i hypoxi 10,14. Denne fremgangsmåde tilvejebringer en fundament, der let kan modificeres til individuelle laboratorie behov, herunder forskellige modelsystemer og forskellige gasser.
Protocol
Discussion
Denne fremgangsmåde giver en strategi til konstruktion af et hypoksisk miljø, der tillader miljøer med nøjagtige koncentrationer af oxygen, der skal holdes i laboratoriet. Disse kamre tilvejebringe en enkel fremgangsmåde til at udsætte organismer til specifikke lave koncentrationer af O2 og overvågning af molekylære og fysiologiske udgange. Den miljømæssige beskrevne kammer samles ved laboratoriet i stedet for kommercielt indkøbte og således kan modificeres til at passe til behovene for eksperimen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmerne af Miller laboratoriet for diskussion og kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en ny Investigator Award fra Nathan Shock Center of Excellence i Basic Biology of Aging til DLM og National Institutes of Health Prisen R00 AG030550 til DLM.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon |
YO-95821-00 (1/8″ FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8″ PTFE)’ R-3603 |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16″) 06363-62 (F. coupler 1/16″) 06363-60 (M. coupler 1/8″) 06363-61 (F. coupler 1/8″) |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16″) |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4″ nut) B-200-3 (1/8″ union tee) B-400-set (1/4″ ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8″ male conn) |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
References
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Recherche en cancérologie. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia – a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -. J., Wang, L. -. Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H., Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. . Oxygen Sensing. 381, (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
