Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation
Summary
Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.
Abstract
Microglia são células da linhagem mielóide que residem no sistema nervoso central (CNS) 1. Estas células desempenham um papel importante na patologia de muitas doenças associadas com neuroinflamação tais como a esclerose múltipla (MS) 2. Microglia em um CNS normais expressar macrófagos CD11b marcador e exibem um fenótipo de repouso por expressar níveis baixos de marcadores de activação, tais como CD45. Durante os eventos patológicos no SNC, a microglia tornar-se activado, tal como determinado por supra-regulação de CD45 e outros marcadores 3. Os fatores que afetam microglia fenótipo e funções no sistema nervoso central não são bem estudadas. MicroRNAs (miRNAs) são uma família em crescimento de moléculas conservada (~ 22 nucleótidos de comprimento) que estão envolvidas em muitos processos fisiológicos normais tais como o crescimento e diferenciação celular 4 e patologias tais como a inflamação 5. MiRNAs regular negativamente a expressão de genes alvo determinados por ligação sequências complementares doIR mRNAs e desempenham um papel importante na activação de células imunes inatas incluindo macrófagos 6 e 7 microglia. A fim de investigar miRNA vias mediadas que definem o fenótipo microglial função biológica, e para distinguir microglia de outros tipos de macrófagos, é importante para avaliar quantitativamente a expressão de microRNAs particulares em subconjuntos distintos de CNS residente microglia. Os métodos comuns para medir a expressão de miRNAs no SNC incluem PCR quantitativo a partir de tecido neuronal geral e hibridação de situ. No entanto, PCR quantitativo a partir de homogeneizado de tecido inteiro não permite a avaliação da expressão de miRNA em microglia, que representam apenas 5-15% das células de tecido neuronal. A hibridação in situ permite a avaliação da expressão de microRNA em tipos de células específicos nas secções de tecido, mas este método não é inteiramente quantitativa. Neste relatório nós descrevemos um quantitativo e senstivo método para a detecção de miRNA por PCR em tempo real em microglia isolado a partir de CNS normais ou durante neuroinflamação utilizando encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de ratinho para a MS. O método descrito irá ser útil para medir o nível de expressão de microRNAs em microglia no SNC normais ou durante neuroinflamação associado com várias patologias, incluindo esclerose múltipla, lesão, acidente vascular cerebral traumática, doença de Alzheimer e tumores cerebrais.
Protocol
Discussion
Recentemente interesse significativo foi dado a microglia e envolvimento destas células em muitas patologias associadas com neuroinflamação e neurodegeneração. Além disso, o papel de microRNAs na diferenciação de células imunes e cancro dramaticamente aumentado ao longo dos últimos 5,10 vários anos. Nós previamente relatado o papel de miR-124 na manutenção do fenótipo não-activado ou de repouso da microglia no CNS normais 7, mas o papel dos outros tipos de microRNAs em microglia fen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi suportado pelo NIH R01 NS071039-01A1 bolsa de investigação.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
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