Utarmning och Beredning av makrofager i möss
Summary
Makrofager spelar en central roll i homeostas och patologi i många vävnader. Protokollet presenteras här beskriver metoder för förbruka makrofager<em> In vivo</em> Härrör polariserade makrofager från benmärg aspirat och adoptivt överföra makrofager i möss. Dessa tekniker kan bestämma den roll som polariserade makrofager spelar i hälsa och sjukdom.
Abstract
Makrofager är viktiga aktörer i det medfödda immunsvaret mot infektiös utmaning eller skada, inleda det medfödda immunförsvaret och leda det förvärvade immunsvaret. Makrofag dysfunktion kan leda till oförmåga att montera en lämplig immunrespons och som sådan, har implicerats i många sjukdomsförlopp, inkluderande inflammatoriska tarmsjukdomar. Makrofager visa polariserade fenotyper som i stort sett delas in i två kategorier. Klassiskt aktiverade makrofager, aktiverade genom stimulering med IFNy eller LPS spelar en väsentlig roll i gensvar på bakteriell utmaning medan alternativt aktiverade makrofager, aktiverade med IL-4 eller IL-13, delta i skräp eliminerande och vävnadsombildning och har implicerats i lösningen fas av inflammation. Under ett inflammatoriskt svar in vivo, är makrofager mitt bland en komplex blandning av infiltrera immunceller och kan delta genom att förvärra eller resolving inflammation. För att definiera rollen av makrofager in situ i ett helt djurmodell, är det nödvändigt att undersöka effekten av förbruka makrofager från komplex miljö. Att ställa frågor om vilken roll makrofag fenotyp in situ, kan fenotypiskt definierade polariserade makrofager härledas ex vivo, från benmärgsaspirat och läggs tillbaka till möss, med eller utan föregående utarmning av makrofager. I protokollet som presenteras här klodronat-innehållande liposomer, mot PBS injicerade kontroller användes för att utarma colonic makrofager under dextran natriumsulfat (DSS)-inducerad kolit i möss. Dessutom har polariserade makrofager härledda ex vivo och överfördes till möss genom intravenös injektion. En nackdel med detta tillvägagångssätt är att klodronat-innehållande liposomer bryter alla professionella fagocyter, däribland både dendritiska celler och makrofager så att se till att effekten observerades av utarmning är makrofag-specifik, beredning of fenotyp genom adoptiv överföring av makrofager som är nödvändigt. Systemisk makrofag utarmning i möss kan också uppnås genom återkorsning möss på en CD11b-DTR bakgrund, vilket är ett utmärkt komplement. Fördelen av klodronat-innehållande liposommedierad utarmning är att den inte kräver tid och kostnad involverad i återkorsning möss och den kan användas i möss oberoende av bakgrunden till möss (C57BL / 6, Balb / c-, eller blandad bakgrund ).
Protocol
Discussion
Makrofager är fagocytiska celler som spelar en viktig roll i immunsystemet. De är ansvariga för initiering av medfödda immunresponsen och rikta den förvärvade immunresponsen. Vanligtvis är klassiskt aktiverade makrofager aktiveras genom IFNy eller LPS och ansvarar för att eliminera patogener och montering ett inflammatoriskt svar 1. Omvänt är alternativt aktiverade makrofager, aktiverade med IL-4 eller IL-13 och spelar en roll i skräp eliminerande och omformning av vävnader under upplösningen av …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en "Grant till förmån för forskning" från Crohns och kolit Foundation of Canada till LMS, som stöds av en kanadensisk Association of Gastroenterology / kanadensiska Association of Health Research / Crohns och kolit Foundation of Kanada New Investigator Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | |
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | |
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 |
| IMDM | Invitrogen | 12440 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 |
Table 1. Specific reagents used in this protocol.
References
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
