암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭
Summary
RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 녹아웃 이상의 많은 장점을 보유하고 광범위하게 유전자 기능 연구의 도구로 사용되었습니다. DNA를 벡터 기반의 RNAi 기술의 발명은 장기적으로 가능한 inducible 유전자 최저했고, 또한 유전자 입을의 가능성을 증가<em> 생체내에서</em>.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi)는 특별히 굴욕적인 표적 mRNAs에 의해 유전자 발현을 억제. 유전자 입을 1 더블 표류하는 작은 간섭 RNA (siRNA)의 발견 이후, RNAi는 유전자 기능 연구에 강력한 연구 도구가되었습니다. 유전자 삭제에 비해 RNAi – 중재 유전자 입을은 그것이 수행되고있는 용이성 및 대부분의 세포 라인의 적합성 등 많은 장점을 가지고 있습니다. 여러 연구가 암 연구에 RNAi 기술의 애플 리케이션을 증명하고있다. 특히 U6 또는 H1 프로 모터에 의해 구동 작은 머리핀 RNA (shRNA)를 생산하는 유전자 벡터 기반 기술의 개발이 가능 2,3 입을 장기와 inducible 유전자를했습니다. 같은 lentivirus와 같은 유전자 조작 바이러스 벡터,와 함께 그것의 사용은 안정 shRNA 표현에 대한 게놈의 DNA로 shRNA 제공 및 / 또는 통합의 높은 효율성을 용이하게합니다.
우리는 detaile을 설명D 절차 shRNA, lentivirus 생산과 세포 감염 및 마우스 이종 이식 모델을 이용한 기능성 연구를 표현하는 lentiviral 벡터의 건설을 포함하여 유전자 기능을 확인하기 위해 DNA를 벡터 기반의 RNAi 기술을 사용하여.
다양한 전략 shRNA 구조를 생성에보고되었습니다. 프로토콜은 PCR 증폭 및 3 조각 내고를 고용하는 것은 직접적으로 그리고 효율적으로 생성하는데 사용될 수 있습니다 여기에서 설명한 shRNA 함유 shRNA 코딩 순서에 어떠한 여분의 염기 인접한를 떠나지 않고 lentiviral 구조를. 이 전략에 의해 만들어 shRNA-발현 카세트가 제한 효소에 의해 절단되기 때문에, 그들은 쉽게 다른 형광이나 항생제 마커와 다른 벡터로 이동할 수 있습니다. 대부분의 상용 transfection의 시약은 lentivirus 생산에 사용할 수 있습니다. 그러나,이 보고서에서, 우리는 90 %의 transfection 효율을 통해 달성할 수있는 칼슘 인산염 석출을 사용하는 경제적인 방법을 제공293T 세포. 제정 shRNA 발현 벡터에 비해 inducible의 shRNA 시스템은 세포 증식에 필수적인 유전자를 쓰러뜨린에 특히 적합합니다. 우리는 음과 양 1 (YY1), 유방암 4,5에서 잠재적인 oncogene의 유전자 입을을 보여주 의해 Tet-에서 inducible shRNA 시스템과 종양 형성에 미치는 영향. lentivirus을 사용하여 연구 결과 검토 및 연구자의 기관 Biosafety위원회 biosafety 프로토콜의 승인이 필요합니다. 동물 모델을 이용한 연구 결과 검토 및 연구자의 교육 기관의 동물 관리 및 사용위원회 (ACUC)에 의해 동물의 프로토콜의 승인이 필요합니다.
Protocol
Discussion
이 프로토콜은 shRNA를 사용하여 유전자를 허물고 생체내의 종양 세포 성장의 발광 생물 이미징을 사용하여 생물 학적 효과를 시각화하는 방법을 설명합니다. shRNA의 대상 사이트 (BamHI, HindIII와 EcoRI) 사용되는 세 개의 제한 사이트의가 없어야합니다 subcloning입니다. 드문 경우 이러한 사이트 중 하나라도 존재하면, 추가적인 제한 효소는 구조를 발전시키고 그것을 대체하는 데 사용할 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 연구 학자 미국 암 협회에서 보조금 (116403-RSG – 09-082-01-MGO)와 GS의 웨이크 포레스트 대학 보건 과학 교내 자금에 의해 부분적으로 지원되었다. DBS는 NCI 훈련 보조금 5T32CA079448에 의해 지원되었다.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
References
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