基于DNA载体的RNA干扰在癌症研究基因功能
Summary
RNA干扰（RNAi）拥有超过基因敲除的许多优点，在基因功能研究的工具已被广泛使用。基于DNA载体的RNAi技术的发明，已作出长期和诱导基因敲除可能，也增加了基因沉默的可行性<em>在体内</em>。
Abstract
专门降解靶mRNA，RNA干扰（RNAi）抑制基因的表达。双链小干扰RNA（siRNA）在1基因沉默的发现以来，RNA干扰已成为强大的研究工具，在基因功能研究。 RNAi介导的基因沉默基因缺失相比，具有许多优点，如与它进行的易用性和适合大多数细胞株。多项研究已经证明，在癌症研究RNAi技术的应用。 DNA载体为基础的技术，以生产小发夹RNA（shRNA）由U6或H1启动驱动的发展，特别是长期和诱导的基因沉默可能2,3。其组合使用遗传工程病毒载体如慢，有利于高效率的shRNA交付和/或集成到稳定的shRNA表达的基因组DNA。
我们描述1 detaile的ð程序使用的基于DNA载体的RNAi技术，以确定基因的功能，包括建设慢病毒载体表达的shRNA慢病毒生产和细胞感染，并利用小鼠移植瘤模型的功能研究。
据报道，在各种战略已产生的shRNA结构。这里描述协议采用PCR扩增和3片段结扎，可以用来直接和有效地产生shRNA的含不留任何额外的核苷酸毗邻到的shRNA编码序列的慢病毒结构。由于磁带创建这一战略的shRNA表达限制性内切酶可以削减，他们可以很容易地转移到其他载体具有不同的荧光或抗生素标记。大多数商业化的转染试剂可用于生产慢。然而，在这份报告中，我们提供了一个经济的方法，使用磷酸钙沉淀，可以实现90％以上的转染效率293T细胞。相比构shRNA表达载体，诱导shRNA的系统特别适合撞倒必不可少的细胞增殖的基因。我们证明了阴阳1（YY1），潜在的癌基因在乳腺癌4,5基因沉默，一个春节的shRNA诱导系统和肿瘤形成的影响。使用慢病毒的研究需要由一个研究员的机构生物安全委员会审查和批准的生物安全议定书。利用动物模型的研究需要动物协议的动物护理和使用委员会研究员的机构（ACUC）审查和批准。
Protocol
Discussion
本协议描述了一个方法来打倒使用shRNA基因和可视化的生物效应，利用生物发光成像在体内的肿瘤细胞的生长。一个shRNA的目标站点不应该包含任何三个酶切位点（的BamHI，HindIII和EcoRI位），用于亚克隆。在罕见的情况下，当任何这些网站是目前一个额外的限制性内切酶可以用来代替它产生的构造。
在这个协议中的几个关键步骤将加快shRNA慢病毒载体的建设。首先…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
从美国癌症协会的研究学者资助（116403-RSG中-09-082-01-强制性）和广深高速壁间的维克森林大学健康科学基金，支持这项工作的一部分。星展得到了NCI的培训补助金5T32CA079448。
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
References
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