ADN vecteur basé sur l'interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer
Summary
L'interférence ARN (ARNi) possède de nombreux avantages sur inactivation du gène et a été largement utilisé comme un outil dans les études fonctionnelles de gènes. L'invention de l'ADN à base de vecteurs ARNi la technologie a fait à long terme et inactivation génique inductible possible, et a également augmenté la faisabilité de l'inactivation du gène<em> In vivo</em>.
Abstract
L'interférence ARN (RNAi) inhibe l'expression des gènes par ARN messagers cibles dégradant spécifiquement. Depuis la découverte de l'interférence double-brin d'ARN (siRNA) dans le gène silencieux 1, l'ARNi est devenu un puissant outil de recherche dans les études des fonctions des gènes. Par rapport à délétion génétique, gene silencing RNAi-médiation possède de nombreux avantages, tels que la facilité avec laquelle elle est effectuée et son aptitude à la plupart des lignes de cellules. De multiples études ont démontré les applications de la technologie ARNi dans la recherche contre le cancer. En particulier, le développement de l'ADN à base de vecteurs technologie pour produire des petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) entraîné par le promoteur U6 ou H1 a fait à long terme et le gène inductible taire 2,3 possible. Son utilisation en combinaison avec des vecteurs viraux génétiquement modifiés, tels que des lentivirus, facilite des rendements élevés de la prestation des shRNA et / ou l'intégration dans l'ADN génomique pour shRNA expression stable.
Nous décrivons une detaileprocédure d en utilisant l'ADN à base de vecteurs de technologie ARNi afin de déterminer la fonction des gènes, y compris la construction de vecteurs lentiviraux exprimant shRNA, la production de lentivirus et l'infection des cellules, et les études fonctionnelles utilisant un modèle de xénogreffe de souris.
Diverses stratégies ont été signalés dans la génération des constructions shRNA. Le protocole décrit ici employant amplification par PCR et une ligature 3-fragment peut être utilisé pour générer directement et de manière efficace shRNA-constructions contenant lentiviraux sans laisser de côté supplémentaire à une séquence nucléotidique codant shRNA. Étant donné que les cassettes d'expression shRNA-créés par cette stratégie peut être coupé par les enzymes de restriction, ils peuvent être facilement déplacés vers d'autres vecteurs avec différents marqueurs fluorescents ou un antibiotique. La plupart des réactifs de transfection commerciaux peuvent être utilisés dans la production de lentivirus. Toutefois, dans le présent rapport, nous fournissons une méthode économique en utilisant la précipitation au phosphate de calcium qui peut atteindre plus de l'efficacité de transfection de 90% enDes cellules 293T. Par rapport à constitutifs des vecteurs d'expression shRNA, un système inductible shRNA est particulièrement adapté pour abattre un gène essentiel à la prolifération cellulaire. Nous démontrons la gene silencing de Yin Yang 1 (YY1), un oncogène potentiel dans le cancer du sein 4,5, par une inductible Tet-On shRNA système et de ses effets sur la formation de tumeurs. Les recherches utilisant des lentivirus nécessite un examen et d'approbation d'un protocole sur la biosécurité par le Comité de biosécurité de l'établissement d'un chercheur. Les recherches utilisant des modèles animaux nécessite un examen et d'approbation d'un protocole sur les animaux par le Comité de protection des animaux et l'utilisation (ACUC) de l'établissement d'un chercheur.
Protocol
Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour abattre un gène à l'aide shRNA et de visualiser son effet biologique en utilisant l'imagerie bioluminescente de la croissance des cellules tumorales in vivo. Le site cible d'un shRNA ne doit contenir aucun des trois sites de restriction (BamHI, HindIII et EcoRI) utilisé pour sous-clonage. Dans un scénario rare lorsque l'un quelconque de ces sites est présent, une enzyme de restriction supplémentaire peut être utilisée pour la remplacer dans la gén?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par les subventions de recherche (116 403 Scholar-RSG-09-082-01-MGO) de l'American Cancer Society et les fonds intra-muros de la Wake Forest University Health Sciences à GS. DBS a été soutenue par le NCI formation 5T32CA079448 subvention.
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
References
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